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.2014年2月6日；94(2):288-94.
doi:10.1016/j.ajhg.2013.12.017。 Epub 2014年1月16日。

整合素α8隐性突变与人类双侧肾发育不全有关

卡米尔·亨伯特 1, 弗洛拉·西尔伯曼 1, 巴蒂·莫拉尔 2, 梅拉尼·帕里索特 三, 穆罕默德·萨拉特 4, 塞西尔·马森 5, 弗雷德里克·托雷斯 5, 帕特里夏·布兰切特 6, 玛丽·何塞·佩雷斯 6, 尤利亚·彼得罗夫 7, 菲利普·库·范建（Philippe Khau Van Kien） 7, 乔尔·鲁姆 8, 布里吉特·勒罗伊 9, 奥利维尔·格里布瓦尔 1, 卢巴·卡莱吉耶娃 2, 劳伦斯·海德特 10, 雷米·所罗门 11, 科琳·安提纳克 12, 亚历山大·本默拉 1, 索菲·桑尼尔 1, 塞西尔·詹皮埃尔 13
附属公司

整合素α8隐性突变与人类双侧肾发育不全有关

卡米尔·亨伯特等。 美国人类遗传学杂志. .

勘误表in

  • 美国人类遗传学杂志。2014年5月1日；94(5):799

摘要

肾发育不良（RHD）是一种异质性疾病，包括一系列肾脏发育缺陷，包括肾发育不全、发育不全和（囊性）发育不良。一些基因的杂合突变已被确定为各种严重程度的RHD的遗传原因。然而，除了RET突变外，这些基因和突变与双侧肾发育不全无关，RET突变可能与少数病例有关。因此，导致肾脏发育完全缺失的病理生理机制在很大程度上仍不清楚。通过对多个双侧肾发育不全胎儿家族进行全基因组测序，我们在两个家族中发现了整合素α8编码基因ITGA8的隐性突变。已知小鼠体内Itga8纯合基因敲除会导致肾脏发育不全。我们提供了人类ITGA8突变具有破坏作用的证据。这些结果表明ITGA8突变是双侧肾发育不全的遗传原因，并且至少在某些情况下，双侧肾发育不良是一种常染色体隐性疾病。

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数字

图1
图1
隐性的识别ITGA8公司两个双侧肾发育不全家族的突变（A）近亲家族F1中纯合5′剪接位点突变c.2982+2T>c的特征。家族F1（a）分支家系，三名胎儿双侧肾发育不全（黑色），一名儿童单侧肾发育不完全（灰色）。对胎儿F1-1（家系中的II-3）进行外显子测序，从而鉴定出c.2982+2T>c纯合子突变（RefSeq NM_003638.1）。为了验证这种突变对剪接的影响ITGA8公司使用位于外显子27和30的引物对F1-1和对照组的胎肺cDNA进行转录。对照组获得了与正常剪接相对应的347 bp带，而胎儿F1-1扩增了245 bp带。245 bp片段的Sanger测序证实，c.2982+2T>c突变导致外显子28的异常剪接和跳跃，导致34个氨基酸的框内缺失（p.Arg961_Ala994del）。（B） F2家族复合杂合突变的特征。对患有双侧肾发育不全的F2-1和F2-2（家系中的II-2和II-3）进行外显子测序，从而鉴定出两种杂合突变，即外显子17中的5 bp缺失（c.1622_1626delAGGTG）导致移码和截短蛋白（p.Glu541Alafs）∗12） 第13外显子的点突变（c.1219G>a）导致错义改变（p.Gly407Arg）。Sanger测序色谱图显示了缺失的父系起源和错义的母系起源。（C） ITGA8蛋白的弯曲（非活性）结构，用Phyre2程序设计并用PyMOL可视化。由于F1家族中鉴定出的纯合剪接突变而被删除的蛋白质部分的位置以橙色显示（p.Arg961_Ala994del），由于F2家族中鉴定的复合杂合突变而改变的氨基酸的位置以红色显示（p.Gly407Ag和p.Glu541Alafs∗12） 在单一BRA病例中，由于桑格测序确定的杂合突变而改变的氨基酸位置为洋红色（p.Thr255Met）。蛋白质结构域的编号从N-ter到C-ter：1，七叶β螺旋桨头部结构域；2，大腿区域；3、calf1结构域；4，calf2结构域（构成蛋白质胞外部分的结构域1-4）；5、跨膜结构域；6，胞内结构域。
图2
图2
ITGA8 p.Gly407Ag蛋白的亚细胞定位分析（A）WT和ITGA8变异蛋白的免疫荧光亚细胞定位：2×105用含有WT或突变的质粒构建瞬时转染HEK293细胞ITGA8公司将pcDNA3中克隆的cDNA在先前用10μg/ml肾结合蛋白（R&D Systems）在37°C下包被1小时的载玻片上进行铺板，并用1%BSA/PBS再冲洗1小时。在37°C下孵育24小时后，用4%的PFA固定细胞。对于细胞渗透性，在与抗体孵育之前，用0.2%Triton在PBS中处理10分钟。以下主要抗体用于1%BSA/PBS：兔抗整合素α8 1/100（Sigma-Aldrich）和鼠抗PDI 1/200（试验设计）。（B和C）流式细胞术分析细胞表面的α8整合素。（B） 稳定转染WT或突变的HEK293细胞ITGA8公司cDNA构建或空pcDNA3载体和ITGA8蛋白水平通过免疫印迹（兔抗整合素α8 1/1000，鼠抗GAPDH[Millipore]1/3000）控制。（C） 为了进行流式细胞术分析，用Costar细胞提升器从培养板上分离细胞。细胞颗粒与兔抗整合素α8抗体（1/50）在3%BSA/PBS中室温孵育30 min。用PBS洗涤后，用二级抗体（多克隆驴抗兔，Alexa Fluor 488，1/1000）标记细胞。用1%PFA/PBS固定细胞，用FACS Calibur（Becton Dickinson）测定细胞表面α8整合素的含量。数据通过CELLQuest程序（Becton Dickinson）进行分析。阴性对照为与二级抗体单独孵育的细胞株ITGA8 WT（黑色曲线）。
图3
图3
ITGA8 p.Gly407Ag变异对细胞粘附和扩散影响的表征（A-C）通过免疫荧光分析粘附和扩散。（A） 对于每个细胞系，2×105细胞被镀在事先涂有肾连接素的玻璃片上。在37°C下培养45分钟后，用4%PFA固定细胞。与ITGA8 p.Gly407Arg细胞相比，ITGA8（兔抗整合素α8 1/100）、丝状肌动蛋白（罗丹明偶合卵磷脂1/400，Sigma-Aldrich）和paxillin（小鼠抗paxillin-1/50，BD Biosciences）染色显示ITGA8 WT细胞的扩散增强。（B） 通过计算每个细胞系在12个场（放大倍数×63）中粘附细胞的数量来测量细胞粘附。（C） 扩散和未扩散细胞的百分比通过每个细胞系100个细胞的计数来估算（浅灰色，未扩散；中灰色，弱扩散；黑色，强扩散）。（D和E）使用基于阻抗的系统xCELLigence（ACEA Biosciences，Roche）评估寿命期细胞粘附和扩散。E型板在37°C下用10μg/ml肾连接素（Npnt）涂布1小时，并用1%BSA/PBS再漂洗1小时。8×104将稳定转染的HEK293细胞（ITGA8 WT、ITGA8 p.Gly407Arg或空pcDNA3）接种在每个孔中。（D） 从播种后25分钟开始测量细胞指数（CI）。每个CI值对应于三倍±标准偏差的平均值（红色曲线，ITGA8 WT；蓝色曲线，ITGA 8 p.Gly407Arg；黑色曲线，空pcDNA3）。（E） 粘附速度表示为曲线斜率，在播种后的前45分钟计算得出（由D中的垂直线表示）。该图表示两个独立实验的平均值±SEM，每个实验一式三份。**经t检验，p＜0.01。
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