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.2014年1月14日；7（308）：ra4。
doi:10.1126/scisional.2004331。

抗精神病药物激活mTORC1依赖性翻译以增强神经元形态复杂性

希瑟保龄球 1, 张国安, 阿迪蒂·巴塔查里亚, 路易斯·佩雷斯-库斯塔, 凯特琳·戴哈德, 查尔斯·霍费尔, 托马斯·诺伊伯特, 文彪甘, 埃里克·克伦, 摩西五世·赵
附属公司

抗精神病药物激活mTORC1依赖性翻译以增强神经元形态复杂性

希瑟保龄球等。 科学信号. .

摘要

虽然抗精神病药物可以在几个小时内减少精神病行为，但在几周内并没有达到完全疗效，这意味着神经功能可能会出现快速、短期的变化，并巩固为长期的变化。我们发现，抗精神病药物氟哌啶醇（一种多巴胺受体2型（D⁄R）拮抗剂）刺激激酶Akt激活雷帕霉素复合物1（mTORC1）哺乳动物靶点介导的mRNA翻译途径。在初级纹状体D⁄R阳性神经元中，氟哌啶醇介导的mTORC1激活导致核糖体蛋白S6（S6）和真核生物翻译起始因子4E-结合蛋白（4E-BP）磷酸化增加。蛋白质组质谱显示，培养的纹状体神经元急性暴露于氟哌啶醇后，蛋白质合成模式发生了显著变化，包括细胞骨架蛋白质和与翻译机制相关的蛋白质丰度增加。这些蛋白质组学变化与神经元形态复杂性增加相一致，而mTORC1下游效应器的抑制降低了神经元形态复杂性，表明mTORC1-依赖性翻译增强了神经元对氟哌啶醇的反应复杂性。在体内，我们观察到氟哌啶醇注射小鼠皮层神经元中细胞骨架蛋白丰度随形态快速变化而增加。这些结果提示了抗精神病药物的急性和长期作用机制。

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利益冲突声明

竞争利益：无

数字

图1
图1。急性抗精神病药物治疗增加D2R阳性神经元
在Akt抑制剂（Akti）或雷帕霉素（Rap）存在下，用氟哌啶醇（Hal）或二甲基亚砜（Veh）处理原代DIV7小鼠纹状体神经元20分钟。(A类)对暴露于指定条件下的裂解物中磷酸化Akt和总Akt进行Western blot分析（左，代表性blot；右量化n=4，单向方差分析p<0.0001，事后分析Veh vs Hal p<0.01，Hal vs Akti，p<0.001）。(B类)Western blot分析暴露于指定条件下的裂解液中磷酸化的S6和总S6和4E-BP【左，代表性blot；右定量S6（n=3，单向方差分析p<0.0008，Veh vs Hal p<0.05，Hal vs Akti和Hal vs-Rap p<0.01）】和4E-BP（n=3，单向方差分析p<0.0003，Veh vs Hal p<0.05，Hal vs Akti p<0.001，Hal vs Rap p<0.01）。所示的所有图表均为平均值±SEM(C类)免疫荧光检测到纹状体神经元中指示磷酸化蛋白丰度的变化。箭头表示有反应的神经元，星星表示没有反应的细胞。pS6的量化（n=4，单向方差分析p<0.05，所有显示的单个比较p<0.05）和p4E-BP的量化（n=4，双向方差分析p<0.0001，Veh vs Hal p<0.01，Hal vs Akti和Hal-Rap p<0.001）。(D类)D类2几乎所有pAkt增加的细胞都检测到Rs(箭头). 无响应的单元格用星号表示。反应细胞和D的量化2R阳性（D2R+）和D2R-负极（D2R−）细胞（n=3，计109个细胞）。D类2R图像在ImageJ中进行了迭代反褶积，以提高信号的清晰度。(E类)暴露于氨磺吡啶（1μM）或载体20分钟的纹状体神经元中磷酸化Akt和S6的丰度（pAkt，n=3，p＜0.06；pS6，n=3，p＜0.03）。比例尺指示50μm。
图2
图2。急性氟哌啶醇治疗导致mTORC1依赖的蛋白质合成短暂增加
(A类)用氟哌啶醇（Hal）或二甲基亚砜（Veh）和1μg/ml嘌呤霉素处理原代DIV7纹状体神经元30、60分钟或4小时。用Western blotting检测嘌呤霉素。显示了一个具有代表性的斑点。由于信号的强度，4小时的斑点曝光较轻。数据被量化为氟哌啶醇处理样品中嘌呤霉素信号的百分比/归一化为肌动蛋白的载体处理样品中的嘌呤菌素信号，并显示为平均值（30分钟；n=8，p=0.007；60分钟，n=7，p=0.005；4小时，n=4，不显著）。Actin是一个加载控件。(B类)S6K1 shRNA或多西环素诱导（DOX）显性负4E-BP AA对氟哌啶醇介导的翻译刺激的影响。4E-BP AA“开”（Dox；n=4）和“关”（No Dox；n=3）状态的数据在面板A中进行了量化。*p=0.02）。含或不含S6K1抑制剂（S6K1i）的多西环素，n=3，由于信号相对较轻，未定量。HA表示存在4E-BP AA。肌动蛋白是一种负载控制。(C类)S6K1敲低（S6K1 shRNA）或对照（S6K1加扰）对氟哌啶醇诱导的puromocyin掺入增加的影响。数据按面板A进行量化（n=4，p=0.03，）。(D类)每个实验中都对S6K1敲除的有效性进行了量化，敲除平均值为41%（n=4 p<0.0003）。(E类)在用于嘌呤霉素分析的相同条件下，暴露于载体或氟哌啶醇的纹状体神经元中S6和克雷菊酯丰度的Western blot分析（%氟哌啶醇/载体归一化为肌动蛋白负载控制）。（S6，n=3，p=0.003）（氯菊酯，n=4，p=不显著）。(F类)Western blot分析暴露于载体或氟哌啶醇（20μM，n=7，p=0.027）、利培酮（利培酮100 nM，n=，5，p<0.06）或氨磺吡啶（Ami，1μM，n=5，p=0.08）4小时的纹状体神经元中eEF2丰度。所有图表均为平均值±SEM，并通过Student t检验进行分析。P<0.05被认为是显著的，用星号标记；P<0.1用#标记。
图3
图3。氟哌啶醇治疗导致参与蛋白质合成并与细胞骨架相关的蛋白质发生特定的早期蛋白质组学变化
(A）氟哌啶醇或载体治疗48小时后，通过质谱测定的所有标准化蛋白质的代表性图，并进行SILAC标记。(B类)在48小时质谱分析中，对氟哌啶醇处理后增加的候选蛋白质进行生物信息学分析。该图显示了UniProtKB中前五类蛋白质丰度变化的频率（见材料和方法，表S4）。翻译=与蛋白质翻译相关的蛋白质；mRNA=与mRNA合成和运输相关的蛋白质；细胞骨架=与细胞骨架相关或部分细胞骨架的蛋白质；膜=与质膜整合的蛋白质；释放=与突触小泡释放或突触胞吐有关的蛋白质。(C类)前5个候选蛋白质类中所有蛋白质的标准化折叠变化。这些符号并不表示任何特殊含义。彩色方块对应于B中着色的类(D类)暴露于氟哌啶醇或载体24小时的DIV7纹状体神经元裂解物的Western blot分析。分析了候选蛋白S6（n=4，p=0.06）、ARMS（n=3，p<0.0001）和MAP2（n=3，p=0.02），以及GSK3β，一种非候选蛋白（n=4,p=0.006）。(E类)用0.25 mg/kg氟哌啶醇或载体治疗24小时的成年小鼠纹状体裂解物中ARMS和MAP2的Western blot分析。ARMS（n=6/组，p=0.048）；MAP2（n=6/组，p=0.08）。所有图表均为平均值±SEM，并通过Student t检验进行分析。P<0.05被认为是显著的，用星号标记；p<0.1被视为趋势水平，并标有#。
图4
图4。氟哌啶醇治疗导致纹状体DARPP32阳性神经元的形态学复杂性增加
初级纹状体神经元与野生型皮层神经元共培养（2:3比例），生长至DIV14，并暴露于载体、氟哌啶醇、氨磺吡啶或利培酮中24小时。用抗DARPP32抗体对神经元进行染色，并通过Sholl分析量化形态学复杂性。所示图像经过线条增强，便于可视化。在图像上量化体细胞100μm内的交点数量，无需进行线条增强。(A类)氟哌啶醇对野生型纹状体神经元形态复杂性的影响。（n=4，p<0.000001，分析的细胞数=19（溶媒治疗组），20（氟哌啶醇治疗组）(B类)非典型抗精神病药物对野生型纹状体神经元形态复杂性的影响。利培酮（n=3，p=0<0.002，分析的细胞数=24，用于载体治疗，23用于药物治疗）；阿米索必利（n=3，p<0.01，分析细胞=24，用于载体治疗，21用于药物治疗）。(C类)氟哌啶醇对表达4E-BP AA的纹状体神经元的影响。4E-BP AA-表达纹状体神经细胞与上述野生型皮层神经元共培养，然后用多西环素诱导过夜，并暴露于氟哌啶醇24小时。对DARPP32和4E-BP AA上HA标记均染色阳性的细胞进行Scholl分析。(D类)氟哌啶醇对纹状体神经元的影响，其中S6K1被敲低。如上所述，S6K1 shRNA表达的纹状体神经元与野生型皮层神经元共培养，并暴露于氟哌啶醇24小时。对标记shRNA-表达细胞的DARPP32和GFP染色阳性的细胞进行Scholl分析。（n=3，p=不显著）。比例尺指示50μm。所有显示的图表均为平均值±SEM。星号表示p≤0.06。
图5
图5。氟哌啶醇治疗导致体外纹状体神经元和体内皮层第5层锥体神经元的棘突增加
(A类)初级纹状体培养物与皮层神经元共培养，生长至DIV14，并用氟哌啶醇或载体治疗24小时。使用ImageJ处理图像，并在可检测到的初级和次级投影上量化脊椎。显示了具有代表性的骨骼图像，并对其进行了线条增强以实现可视化。对符合规定标准（见材料和方法）的脊柱进行量化（n=4，p<0.0001）。Primary（初级）表示脊椎在体细胞的初级投射上计数；secondary表示从主投影分支的次级投影上计数的脊椎。比例尺指示5μm。S6K1 shRNA处理的神经元(B类)体内研究的实验程序。一个月大的Thy-1 YFP小鼠在初始成像期（第0天）之前接受手术放置头部固定棒，进行成像，然后注射氟哌啶醇或载体，24小时后再次成像。(C类)为了清晰起见，显示了经处理的大脑皮层Thy-1 YFP阳性神经元的代表性图像。星号表示丝状伪足，闭合箭头表示形成的脊椎，开放箭头表示消除的脊椎。绘制消除或形成的脊椎数。（Veh=4，Hal=6，p=0.006）。所有图表均为平均值±SEM，并通过Student t检验进行统计差异分析。p≤0.05用星号表示。
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