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.2014年2月28日；289(9):6110-9.
doi:10.1074/jbc。M113.524801。 Epub 2014年1月12日。

细菌热休克蛋白（Hsp）90和Hsp70伴侣分子之间的物理相互作用介导了它们对变性蛋白质复性的协同作用

中本仁治 1, 藤田贤惠, 阿古鲁·奥塔基, 渡边佐藤, Shoichi Narumi公司, 丸山隆弘, 埃米·苏埃纳加, 三野智子, Penmetcha K R Kumar公司, 皮埃尔·戈鲁宾诺夫, 吉川博文
附属公司

细菌热休克蛋白（Hsp）90和Hsp70伴侣分子之间的物理相互作用介导了它们对变性蛋白质复性的协同作用

中本仁治等。 生物化学杂志. .

摘要

在真核生物中，热休克蛋白90（Hsp90）是一种重要的ATP依赖性分子伴侣，与许多客户蛋白相关。HtpG是Hsp90的原核同源物，对蓝藻的耐热性至关重要，在体外它能有效抑制变性蛋白质的聚集。了解非天然客户蛋白如何与HtpG重折叠结合，对于理解HtpG在压力下的基本作用至关重要。在这里，我们通过酵母双杂交方法、免疫沉淀分析和表面等离子共振技术证明HtpG与DnaJ2和DnaK2发生物理相互作用。DnaJ2属于II型J蛋白家族，与DnaK2或HtpG结合具有亚摩尔亲和力，与HtpG连接具有微摩尔亲和力。DnaJ2和HtpG都能促进DnaK2对ATP的水解。虽然在DnaK2伴侣系统的协助下，HtpG增强了脲变性乳酸脱氢酶和热变性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的天然复性。在DnaK2辅助的变性底物复性中，HtpG不能替代DnaJ2或GrpE。热变性苹果酸脱氢酶不能单独通过DnaK2伴侣系统进行复性，它首先被HtpG捕获，然后转移到DnaK1进行复性。底物与HtpG的解离是ATP依赖性的或不依赖于底物的，这表明HtpG和DnaK2伴侣系统之间存在两种协同作用机制。

关键词：蓝藻；DnaJ；DnaK；热休克蛋白；热休克蛋白70；热休克蛋白90；HtpG；分子伴侣；蛋白质聚集。

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数字

图1。
图1。
HtpG与DnaJ2和DnaK2的双杂交相互作用。酵母细胞在30°C的SC板上生长1周，该SC板缺乏亮氨酸、色氨酸和腺嘌呤。通过交配携带pGBTK或其衍生物的PJ69-4Aa细胞构建二倍体菌株(诱饵)含有pGAD424或其衍生物的PJ69-4Aa细胞(猎物)，其中每个衍生质粒包含图中所示的各种片段。HtpG-C型表示HtpG的C末端一半（氨基酸344-639）。
图2。
图2。
DnaJ2与DnaK2的物理相互作用(一个)或HtpG(B类).用于免疫沉淀(IP（IP）)在4°C下，将含有1.0 nmol DnaJ2和/或1.0 nmol的DnaK2混合物或含有1.0 nmolDnaJ2和/或1.0nmol HtpG的混合物在含有蛋白质G-Sepharose 4 Fast Flow珠和偶联的DnaK1或HtpG抗体的情况下培养2 h。用SDS-PAGE（12%）分离与珠子共沉淀的蛋白质，并用考马斯亮蓝染色。作为参考，在同一凝胶中分析了0.05 nmol的DnaJ2、DnaK2和HtpG，并显示在左侧。DnaJ2、DnaK2和HtpG表示为箭头位于凝胶中间的最大条带是IgG重链。
图3。
图3。
利用表面等离子体共振生物传感器对伴侣-伴侣/共伴侣相互作用进行动力学分析。共振单位的增加表明注入的分析物与传感器芯片上的配体实时结合。A、，HtpG（分析物）与固定化DnaJ2（配体）的相互作用。B、，DnaK2与固定化DnaJ2的相互作用。C、，HtpG与固定化DnaK2的相互作用。
图4。
图4。
协同伴侣和HtpG增强DnaK2的ATP酶活性。来自三个重复的数据表示为平均值±S.E。A、，DnaJ2和GrpE对DnaK2 ATP酶活性的影响。在1 ml反应混合物中，4 nmol DnaK2(K（K）)，0.8 nmol DnaJ2(J型)和/或0.4 nmol GrpE(E类)当时在场。B、，HtpaG和胚根酚对DnaK2和HtpaG ATP酶活性的影响。在1毫升反应混合物中，2毫摩尔DnaK2(K（K）)，2 nmol HtpG(G公司)和/或3 nmol的根醇(R（右）d日)当时在场。这个阴影柱显示了通过添加分别测量的DnaK2和HtpG活性而获得的活性。C、，HtpG增强DnaK2的ATP酶活性。在1 ml含有2 nmol DnaK2、18 nmol胚根醇和不同量HtpG的反应混合物中测量DnaK_2的ATP酶活性。
图5。
图5。
通过DnaJ2、GrpE和HtpG增强DnaK2辅助蛋白质的复性。 一个和B、，热变性G6PDH（0.25μ米)在6μ米DnaK2号机组(K（K）), 1.2 μ米DnaJ2型(J型), 0.6 μ米GrpE公司(E类)和/或0.5μ米HtpG公司(G公司). G6PDH在52°C下热处理后，添加图中所示的伴侣和/或共伴侣后，在25°C下分析酶活性变化的时间进程。为了测量伴侣诱导的依赖性折叠，BSA的量与DnaK2伴侣系统（DnaK2/DnaJ2/GrpE）的量相同添加了，而不是伴侣系统。在热变性G6PDH中仅添加DnaK2或DnaJ2时，获得了与BSA存在时相同的结果。C、，HtpG促进DnaK2伴侣系统辅助G6PDH复性。如上所述，在25°C下，在DnaK2/DnaJ2/GrpE伴侣系统存在下进行G6PDH复性。0.5 μ米HtpG公司(G公司)在不存在或存在1μ的情况下添加米根醇(R（右）d日)溶于二甲基亚砜或同等体积的二甲基亚磺酸(天M（M）)与添加的radicol溶液相同。D、，HtpG增强DnaK2伴侣系统辅助LDH复性。在25°C下，在尿素和DTT存在下，LDH变性后，LDH（0.25μ米)添加6μ米DnaK2号机组(K（K）), 1.2 μ米DnaJ2型(J型)，0.6微米米GrpE公司(E类). 0.5 μ米HtpG公司(G公司)在没有或存在根醇的情况下添加(R（右）d日)或二甲基亚砜(天M（M）)如上所述。注意0.5μ米HtpG公司(G公司)在没有DnaK2伴侣系统的情况下，没有增强复性。来自三个重复的数据以平均值±标准误差表示误差线被绘图符号覆盖。
图6。
图6。
热变性MDH与HtpG的稳定结合以及通过HtpG与DnaK2伴侣系统的协同作用使MDH重新折叠。 A、，HtpG抑制MDH聚集。0.2 μ米MDH是在不存在的情况下培养的(不添加)或存在0.1、0.2或0.4μ米HtpG在45°C下放置20分钟。由于热变性MDH的聚集，在360 nm处测量了表观吸光度的增加。0.2μ存在时吸光度发生变化米不含MDH的HtpG与存在0.2μ米MDH和0.4μ米为了清楚起见，HtpG和因此从图中删除。B、，HtpG与MDH的物理相互作用。对于免疫沉淀测定，将含有0.5 nmol MDH和/或1.0 nmol HtpG的混合物在45°C下孵育25分钟。离心后，将具有偶联HtpG抗体的蛋白G-Sepharose 4 Fast Flow珠加入上清液部分，并在4°C下孵育2小时。用SDS-PAGE（12%）分离与珠子共沉淀的蛋白质，并用考马斯亮蓝染色。HtpG公司，重链IgG(免疫球蛋白G(碳氢化合物))、MDH和IgG轻链(免疫球蛋白G(信用证))显示。C、，MDH（0.25μ米)在25°C下，在5μ米DnaK2号机组(K（K）), 10 μ米DnaJ2型(J型)、和5μ米GrpE公司(E类). 这个线由表示HtpG公司→英国标准协会显示了MDH在0.5μ米然后在没有DnaK2伴侣系统的情况下，在BSA存在下进行HtpG和25°C下的复性反应。注意0.5μ米HtpG本身并没有增强复性。还需要注意的是，当MDH在有BSA存在但没有HtpG的情况下发生热变性时，DnaK2伴侣系统不能显著帮助MDH复性(英国标准协会→韩国经济株式会社).D、，MDH（0.25μ米)在45°C温度下，在2倍浓度的HtpG存在下变性30分钟，然后在25°C温度和5μ米DnaK2号机组(K（K）), 10 μ米DnaJ2型(J型)、和5μ米GrpE公司(E类). 5 μ米根醇(R（右）d日)或相同体积的二甲基亚砜(天M（M）)因为添加了根醇。C、，来自两个重复的数据表示为平均值。D、，来自三个重复的数据显示为平均值±S.E误差线被绘图符号覆盖。
图7。
图7。
Ⅱ型J-蛋白的一级结构大肠杆菌和细长S.elongatus和抗聚集活性长柄链球菌DnaJ2与DnaK2和HtpG相比。 A、，的序列对齐大肠杆菌CbpA和长柄链球菌DnaJ2。使用Clustal X对序列进行比对。虚线代表差距。安星号上面的序列表明一个位置有一个单一的，完全保守的残基。:表明以下强基团之一是完全保守的：STA、NEQK、NHQK、NDEQ、QHRK、MILV、MILF、HY或FYW。表明以下较弱的基团之一是完全保守的：CSA、ATV、SAG、STNK、STPA、SGND、SNDEQK、NDEQHK、NEQHRK、FVLIM或HFY。B、，DnaJ2、HtpG或DnaK2对MDH聚集的影响。0.2 μ米MDH是在不存在的情况下培养的(不添加)或在45°C下存在DnaJ2、HtpG或DnaK2 20分钟。每个伴侣和共伴侣的最终浓度如图所示。在添加MDH后测量360 nm处的表观吸光度增加。
图8。
图8。
HtpG（Hsp90）/DnaK（Hsp70）伴侣系统中变性蛋白质的可能折叠途径。这个箭头指示伴侣/共同伴侣之间底物转移的方向。虚线指出伴侣和共同伴侣之间的物理相互作用。天和N个分别表示未折叠/错误折叠/变性蛋白质底物及其天然形式。A、，真核系统中Hsp70和Hsp90之间的协同作用（32）。底物被Hsp40或Hsp70吸收。Hsp90在从Hsp70获得底物后，为复性提供最后的帮助。此步骤取决于ATP。Sti1或Hop与Hsp90和Hsp70物理上相互作用，促进伴侣的相互作用及其伴侣功能。B、，蓝藻HtpG通过DnaJ2与DnaK2的协同作用。我们假设DnaJ2促进HtpG和DnaK2之间的物理交互。B-1，如果尿素变性的LDH和热变性的G6PDH没有形成大的聚集体，DnaJ2可能会招募一种蛋白质底物并转移到DnaK2。或者，底物可以直接与DnaK2结合。然后，可以在DnaK2的帮助下完成底物的重折叠。如果底物不容易折叠，并且重复与DnaK2的结合和解离，则会像真核系统一样转移到HtpG进行折叠。HtpG辅助的最后一步依赖于ATP。HtpG增强DnaK2的ATP酶活性，这可能促进DnaK_2和HtpG的协同作用。B-2，在MDH等聚集蛋白的情况下，HtpG将其结合，使其在压力下保持可溶，然后将其转移到DnaK2，以帮助其在非压力条件下进行复性。HtpG和DnaK2之间的底物转移不依赖于ATP。
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