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.2014年3月；62(3):411-27.
doi:10.1002/glia.22613。 Epub 2014年1月10日。

DNA甲基化在中枢神经系统发育过程中作为Kir4.1表达的关键调节器发挥作用

Sinifunanya E Nwaobi西尼福南雅E Nwaobi西尼福南雅E Nwaobi西尼福南雅E Nwaobi西尼福南雅E Nwaobi西尼福南雅 1, 艾丽卡·林, 巴西银行, 米歇尔·奥尔森
附属公司

DNA甲基化在中枢神经系统发育过程中作为Kir4.1表达的关键调节器发挥作用

Sinifunanya E Nwaobi公司等。 格利亚. 2014年3月.

摘要

Kir4.1是一种胶质特异性K+通道，对中枢神经系统的正常发育至关重要。使用Kir4.1的全局和胶质特异性敲除进行的研究表明，中枢神经系统发育异常，通道丢失。具体而言，Kir4.1基因敲除动物的特征是共济失调、严重髓鞘减退和出生后早期死亡。此外，Kir4.1已成为几种中枢神经系统疾病的关键参与者。值得注意的是，Kir4.1蛋白表达降低发生在一些人类中枢神经系统疾病中，包括中枢神经系统缺血性损伤、脊髓损伤、癫痫、ALS和阿尔茨海默病。尽管Kir4.1在正常和病理条件下具有新的意义，但其调节机制尚不清楚。在这里，我们报道了CNS中第一个K+通道的表观遗传调控。大鼠Kir4.1表达的强大发育上调与Kir4.1基因KCNJ10的DNA甲基化降低一致。染色质免疫沉淀揭示了KCNJ10和DNA甲基转移酶1在发育过程中的动态相互作用。最后，KCNJ10启动子的去甲基化对于转录是必要的。这些发现表明DNA甲基化是Kir4.1转录的关键调节器。鉴于Kir4.1在正常中枢神经系统发育中的重要作用，了解这种K+通道的调节对于了解正常胶质细胞生物学至关重要。

关键词：星形胶质细胞；发展；表观遗传学。

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数字

图1
图1。Kir4.1蛋白经历强大的发育上调，具有区域特异性表达水平
（A-E）Western blotting显示，Kir4.1蛋白在不同脑区随年龄从p0增加到p100而增加。Kir4.1分别以约50kDa和200kDa的单体和四聚体形式出现。Tubulin或gapdh被用作负荷控制。(G公司)皮质western blot的密度分析提供了Kir4.1发育上调的代表性量化。(F类)对一个年龄段（p28）不同脑区的蛋白质分析显示Kir4.1的区域特异性表达水平。与脊髓（SC）和脑干（BS）相比，皮层（C）、海马（H）和小脑（M）的Kir4.1蛋白水平较低，而脊髓（SC，BS）的Kir 4.1蛋白水平最高。(H（H）)密度分析量化了中枢神经系统中Kir4.1表达的区域特异性水平。
图2
图2。KCNJ10 mRNA水平与Kir4.1蛋白的发育增加平行
（A）qPCR分析显示皮层、小脑和海马中KCNJ10转录物从p0增加到p100。减少了25倍和15倍KCNJ10型脊髓和脑干分别在p100处观察到转录本。对于qPCR分析，折叠表达与gapdh相关，并归一化为皮层的p0（所有脑区和年龄的n=3）。(B类和C)显示了FACS分类实验中使用的转基因eGFP-S100β动物大脑皮层切片的代表性图像。GFAP（红色）染色显示eGFP表达与GFAP阳性星形胶质细胞共定位。虚线框表示图2C中显示的缩放区域。比例尺为50μm。(天和E类)GFAP和MAP2的qPCR分析作为FACS的对照；与未分选细胞（NS）相比，在FACS细胞中观察到GFAP的同时增加和MAP2的减少。(F类)与未分类（NS）样本相比，eGFP+星形胶质细胞（FACS）的FACS表现出2.5倍和12.6倍的富集KCNJ10型分别在1周龄（p5-7）和3周龄（p20-21）的动物中进行转录。误差条代表标准误差。
图3
图3。生物信息学分析KCNJ10型基因揭示了3个CpG岛
Kir4.1大鼠序列被输入Applied Biosystems Methyl Primer Express。确定了3个CpG岛。CpG岛1为1198 bp，跨越第一个非编码外显子。CpG岛2为514 bp，位于内含子片段。CpG岛3为438 bp，与第二编码外显子重叠，包括该外显子的转录起始位点。
图4
图4。KCNJ10型显示发育过程中的差异甲基化
通过MS-HRMA评估皮层Kir4.1 CpG岛的甲基化状态(A类)和脊髓组织(B类)来自p0、p28和p60年龄段的动物。标记每个区域内的CpG位点。指出了非目标站点（NT）。CpG1在皮层和脊髓中的甲基化水平最低。大脑皮层和脊髓的12个区域中有9个和12个区域的7个区域的甲基化水平随着年龄的增长而降低。对于两个大脑区域：n=4；误差线代表s.e.m.；*（P<0.05）；**（P<0.01）***（P<0.001）。(C)显示了Kir4.1 CpG岛1-3中发现的CpG位点甲基化百分比的热图表示。通过焦磷酸测序分析p0、p28和60岁时大脑皮层和脊髓（SC）中的位点。皮层和脊髓表现出平行的甲基化模式；然而，SC在总靶向CpG位点中54.3%的甲基化水平较低。在皮层和脊髓中均显示出显著变化的位点中，95.5%的位点具有较低的SC甲基化水平。表S3和表S4总结了随着年龄的增长表现出显著变化的站点。每个年龄段的n=4，p60时的SC除外，n=3。
图5
图5。FACS分类的星形胶质细胞显示出类似的DNA甲基化状态的降低KCNJ10型
对EGFP+星形胶质细胞进行FACS分类，并从1周、3周和7周大的动物（3-4只动物/组）中分离基因组DNA。进行焦磷酸测序以评估CpG岛2中每个CpG位点的DNA甲基化水平(A类)和CpG岛3(B类)在每个时间点，误差条表示s.e.m；*（P<0.05）；**（P<0.01）***（P<0.001）。与从全脑匀浆中分离出的DNA中观察到的结果类似，从富含星形胶质细胞的DNA中分离出来的DNA显示，随着成熟，DNA甲基化水平降低。
图6
图6。DNMT1在发育过程中与Kir4.1 DNA表现出动态相互作用
使用染色质免疫沉淀和随后的qPCR分析（ChIP-qPCR）评估DNMT1与Kir4.1在两个区域的相互作用，这两个区域甲基化水平和年龄相关变化存在差异。IgG作为阴性对照，用于背景信号的归一化。RNA聚合酶II用作阳性对照。在CpG岛1中发现的位点20-43在衰老期间甲基化水平较低且停滞，而在CpG-岛2中发现的位点62-67甲基化水平较高，在衰老期间显著降低。(A类)ChIP分析表明，CpG岛1中评估的位点在从p0到p60的老化过程中，DNMT1相互作用几乎没有变化，富集倍数分别为3.74和3.89。(B类)相反，CpG岛2中评估的位点在发育过程中表现出DNMT 1相互作用的减少，p0时的褶皱富集度为14.02，而p60时为1.81。对于每个年龄，n=3；误差线代表标准误差*（P<0.05）。
图7
图7。DNMT抑制剂可以驱动Kir4.1转录在体外
(A类)使用5-aza、Zebularine（zeb）和RG-108导致药物治疗后4天Kir4.1转录显著增加。将样本归一化为gapdh，折叠表达与每种药物的对照有关（用0μM表示）。n=3个单独实验；误差线代表s.e.m.；*（P<0.05）；**（P<0.01）***（P<0.001）。（B）CpG-Kir4.1 CpG岛甲基化示意图如图所示。切割质粒释放Kir4.1 CpG岛，然后使用CpG甲基化酶进行甲基化。甲基化后，CpG岛被重新整合回非甲基化的luc2（荧光素酶）质粒。4.1-CpG 1-3-luc的甲基化（M）通过血红蛋白II消化。血红蛋白II只消化非甲基化DNA。（C、D）荧光素酶报告子分析表明，CpG岛1和2的甲基化导致启动子活性降低（***p<0.0001和*p=0.0257；n=6和n=3）。误差条表示s.e.m。
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