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.2014年1月1日；34(1):66-78.
doi:10.1523/JNEUROSCI.3371-13.2014。

MicroRNA-132富含发育中的轴突，局部调节Rasa1 mRNA，并促进轴突延伸

梅丽莎·汉考克 1, 尼古拉斯·普雷特纳, 杰泉, 约翰·弗拉纳根
附属公司

MicroRNA-132富含发育中的轴突，局部调节Rasa1 mRNA，并促进轴突延伸

梅丽莎·汉考克等。 神经科学. .

摘要

发育中的轴突可以局部合成蛋白质，在轴突生长、引导和再生中发挥作用，但调节轴突mRNA翻译的机制尚不清楚。微RNA（miRNAs）是翻译的重要调节器，但在轴突发育过程中的特征仍然很少。在这里，我们研究了小鼠背根神经节（DRG）轴突，并表明其延伸受到体内外miRNA-处理酶Dicer条件缺陷的损害。轴突定位的筛选鉴定了在发育中的轴突中优先富集的一组特定的miRNA。miR-132的轴突高表达和优先定位，这是一种miRNA，以前已知其在树突中的作用和在主要神经疾病中的失调。miR-132敲除减少了培养的DRG轴突的延伸，而过度表达增加了延伸。miR-132通过机制调节Ras GTPase激活物Rasa1的mRNA，Rasa1是神经元功能的一个新靶点。此外，在切断的轴突中可以看到miR-132对Rasa1翻译的调节，这表明miRNA在轴突中具有局部功能。miR-132在DRG中的表达在体内轴突最大生长期达到峰值，这与其对轴突生长的影响一致，表明其具有发育计时器的作用。总之，这些发现确定miR-132是发展中轴突延伸的积极调节因子，通过抑制Rasa1 mRNA发挥作用，这种机制在轴突内局部起作用。

关键词：轴突发育；局部mRNA翻译；微RNA。

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数字

图1。
图1。
Dicer条件基因缺失导致DRG轴突缺陷。A类，全贴LacZ染色Dicer公司+/+;重量1+/Cre公司;R26R型+/−或Dicer公司flox/flox公司;重量1+/Cre公司;R26R型+/−胚胎E13.5（顶部）和外周蛋白免疫标记Dicer公司+/+重量1+/Cre公司（+/+）或Dicer公司flox/flox公司重量1+/Cre公司E12.5和E13.5（底部）的（−/−）胚胎显示突变爪子的轴突延伸发育不良和异常。箭头表示神经末梢。比例尺，100μm。B类，外周蛋白的定量+E13.5胚胎中每只爪子的神经末梢。C类、足总神经支配的定量。外周蛋白支配的足面积百分比+神经是通过除以外周神经的总面积来计算的+爪子总面积的免疫荧光（IF）。D类E13.5，后肢上皮横切面标记有外周蛋白（绿色）和DAPI核标记（蓝色）。比例尺，50μm。电子，外周蛋白的定量+每100μm的神经末梢终止于表皮。F类E15.5中DRG的横截面Dicer公司（+/+）或（−/−）胚胎被标记为胰岛1/2和TrkA。比例尺，100μm。G公司，胰岛定量1/2+或TrkA+每节DRG神经元。H（H）来自E13.5（+/+）或（−/-）胚胎的DRG外植体培养36 h，并标记NF-M。比例尺，100μM。我，DRG轴突平均长度的定量。J型，用DIC延时显微镜定量轴突延伸率。条形图显示为平均值±SEM*第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页< 0.001 (t吨测试）。
图2。
图2。
筛选DRG神经元和轴突中的miRNAs。A类培养的DRG轴突免疫标记Dicer或Ago2（绿色）。肌动蛋白用指骨样蛋白（蓝色）标记，生长锥轮廓（白线）。比例尺，10μm。B类E13.5 DRG外植体在AXIS多室微流体室（Millipore）中培养，该室以前曾用于分离轴突（Willis和Twiss，2011）。将外植体置于一个隔间内，轴突通过≥150μm的微槽延伸至轴突隔间。培养3d后，用NF-M标记神经元以识别轴突，用DAPI标记细胞核。虚线划定了总神经元（左）和轴突（右）隔室的边界。中间区域存在微沟槽；通过微槽的抗体扩散减少了该区域的强标记。比例尺，50μm。C类，通过qRT-PCR验证轴突纯度。从总神经元或轴突室提取总RNA，β-肌动蛋白和γ-肌动蛋白用qRT-PCR测定mRNA水平。轴突mRNA缺乏γ-肌动蛋白mRNA，仅存在于体细胞中。结果显示为平均值±SEM***第页< 0.001 (t吨测试）。D类，通过qRT-PCR啮齿动物TLDA测量的miRNA的表达水平。结果显示为轴突中相对于总神经元的miRNA富集热图，以对数标度表示（绿色表示轴突富集，红色表示轴突耗尽）。在本实验中，miRNA值由样本中检测到的所有miRNA的平均值进行标准化（详细信息请参见材料和方法）。电子，用qRT-PCR TLDA测定轴突和整个神经元（总）群中miRNAs的表达水平。结果显示为热图，其中绿色强度的增加表示较高的表达水平，显示为每个群体（轴突或总神经元）中总miRNA表达的百分比。miRNAs按轴突表达水平排列(n个= 4).
图3。
图3。
miRNAs富集于轴突，减少于轴突Dicer公司突变神经元。A类，miRNA的表达水平Dicer公司+/+重量1+/Cre公司（+/+）或Dicer公司flox/flox公司重量1+/Cre公司通过qRT-PCR TLDA测量E12.5处的（−/−）DRG。结果显示为Dicer突变体相对于对照的miRNA表达热图，以对数标度表示。Dicer突变体中miRNA耗竭的程度用红色强度表示；突变株中未检测到（n.d.）表达的miRNAs以浅粉红色表示。B类，miRNAs减少的维恩图Dicer公司（−/−）DRG（红色）或富含轴突（绿色）。C类，验证Dicer公司qRT-PCR的敲除TLDA结果显示，Dicer突变DRG中miR-132减少80%（归一化为snoRNA202；n个每个基因型≥3 DRG）。D类，通过qRT-PCR验证TLDA结果，显示miR-132轴突富集。成熟miR-132水平（此处归一化为U6，以便于与之前使用U6归一化轴突分布的研究进行比较；有关详细信息，请参阅材料和方法）显示为相对于总神经元的富集（>13倍），其中总神经元水平等于1(n个= 4).电子，通过qRT-PCR定量分离轴突和总神经元群中的前miR-132水平（归一化为miR-125a–5p）。轴突前miR-132水平显示为相对于总神经元（>45倍）的富集，其中总神经元水平等于1(n个= 4). miR-125a-5p水平用于归一化，因为我们的qRT-PCR TLDA结果（使用平均miRNA归一化方法）显示miR-125a–5p在轴突和总细胞中的表达大致相同；有关详细信息，请参见材料和方法。F类，通过qRT-PCR定量分离轴突和总神经元群中的前体和成熟miR-132水平（均归一化为miR-125a–5p）。显示相对于总神经元的级别，其中总神经元级别等于1(n个= 4).G公司，的图像就地与LNA探针的杂交显示在轴突和生长锥中存在miR-132标记（箭头），以及与对照LNA探针不存在miRNA信号。比例尺，10μm。H（H），轴突中miR-132 LNA AFI的定量。条形图显示为平均值±SEM*第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页< 0.001 (t吨测试）。
图4。
图4。
miR-132调节轴突延伸。A类，不同年龄DRG中miR-132水平的时间分布（归一化为snoRNA61），qRT-PCR。显示的结果是与E12.5水平相关的折叠式变化(n个≥3只幼崽）。B类，E13.5、E15.5和E17.5 DRG中miR-125a–5p表达的时间剖面（归一化为snoRNA61）。显示的结果是相对于E13.5水平的倍数变化(n个≥3只幼崽）。C类，E13.5Dicer公司+/+重量1+/Cre公司用miRNA模拟物或抑制剂以及GFP报告子电穿孔DRG神经元，并培养24小时Dicer公司flox/flox公司重量1+/Cre公司(Dicer公司−/−）平行培养并标记NF-M。比例尺，50μM。D类，轴突长度的定量C类(n个>100 GFP+每种情况下的轴突n个=24Dicer公司−/−轴突）。条形图显示为平均值±SEM*第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页< 0.001; 不另作说明，不重要(t吨测试A类,B类; Tukey's HSD的方差分析事后（post-hoc）测试D类).
图5。
图5。
miR-132目标拉萨1mRNA在神经元中的表达。A类，通过TargetScan算法预测为miR-132靶点的mRNA的Venn图（绿色）；表达miR-132模拟物的细胞中mRNA下调（Grimson等人，2007；NCBI GEO数据库登录号GSE8501；紫色）；和mRNA在胚胎轴突中表达（Zivraj等人，2010；蓝色）。B类，定量拉萨1和Crk1公司mRNA水平（标准化为Gapdh公司)qRT-PCR检测分离的DRG轴突和总神经元。C类，定量拉萨1mRNA表达（标准化为Gapdh公司)图中E12.5Dicer公司+/+重量1+/Cre公司（+/+）或Dicer公司flox/flox公司重量1+/Cre公司qRT-PCR检测（−/−）胚胎。D类Western blot检测用对照、miR-132或miR-29a PNA抑制剂治疗2天的DRG神经元内源性Rasa1蛋白水平。电子，定量拉萨1mRNA表达（标准化为Gapdh公司)通过qRT-PCR对DRG神经元用对照或miR-132 PNA抑制剂治疗2 d(n个= 3).F类、表达对照、miR-132或miR-150抑制剂的Neuro2A细胞，以及具有3′UTR拉萨1萤火虫荧光素酶区域的mRNA下游。显示萤火虫荧光素酶活性标准化为雷尼利亚荧光素酶控制(n个= 3).G公司，定量拉萨1mRNA水平（标准化为Gapdh公司)通过qRT-PCR对转染对照或miR-132模拟物的Neuro2A细胞进行2天的研究(n个= 4).H（H），miR-132模拟物与一个TP共同转染，该TP旨在阻断预测的miR-132-结合位点拉萨1Neuro2A细胞中的3′UTR（Rasa1-TP）或扰乱控制TP（con-TP），以及拉萨1或Crk1公司mRNA水平（标准化为Gapdh公司)通过qRT-PCR测定。与对照TP相比，Rasa1-TP促进了miR-132模拟物对拉萨1mRNA，而Rasa1-TP不影响Crk1公司mRNA，另一个miR-132靶点。我，定量拉萨1mRNA水平（标准化为Gapdh公司)通过E13.5、E15.5和E17.5 DRG中的qRT-PCR。显示的结果是相对于E13.5水平的倍数变化(n个≥3只幼崽）。J型，Rasa1击倒验证拉萨1Western blot分析2次DIV后Neuro2A细胞中的siRNA。Rasa1谱带强度归一化为Erk1/2谱带(n个= 3).K（K）、GFP定量+与GFP报告子共同转染的Neuro2A细胞中的轴突长度以及以下内容：miR-132模拟物、对照模拟物、，拉萨1siRNA、控制干扰siRNA或缺乏拉萨13英尺UTR(拉萨1-Δ3′UTR；n个>每种情况下300个轴突）。L（左）、GFP定量+与GFP报告子、miR-132模拟物或对照模拟物以及Rasa1-TP或con-TP共同转染的Neuro2A细胞的轴突长度(n个>每种情况100个轴突）。条形图显示为平均值±SEM*第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页< 0.001; 不另作说明，不重要(t吨测试B类,C类,E–J公司,L（左）; Tukey's HSD的方差分析事后（post-hoc）测试K（K）).
图6。
图6。
miR-132局部调节拉萨1轴突中的mRNA。A类，培养的DRG轴突和生长锥（插图）免疫标记Rasa1（绿色）和F-actin（红色）的图像。比例尺：10μm；插图，5μm。B类，验证miR-132 PNA抑制剂在3.5小时内在多室微流控室中放置的DRG外植体的轴突中击倒miR-32（见图2B类). 轴突通过微槽延伸到轴突室，从总神经元室中取出培养基，用无菌H代替2O持续5分钟。静水压力阻止回流到轴突室，H2O被移除（连同整个神经元室中的物质）。将PNA抑制剂应用于轴突室3.5 h，提取总RNA。miR-132水平（标准化为Gapdh公司)通过qRT-PCR进行测量(n个= 6).C类，标记为NF-M的DRG外植体的代表性图像。Axons用显微解剖刀从细胞体上切下。比例尺，100μm。D类，用对照组或miR-132 PNA抑制剂处理3.5小时的DRG外植体完整和切断的轴突图像，并标记Rasa1和β3-微管蛋白（Tuj1）。同时，在用PNA抑制剂治疗之前，用环己酰亚胺（CHX）处理切断的轴突20分钟。线扫描显示典型轴突中的Rasa1荧光强度剖面。比例尺，40μm。电子，轴突Rasa1 AFI定量（归一化为Tuj1；n个>60个完整的轴突，以及n个>每种情况下120个轴突被切断）。F类用对照或miR-132 PNA抑制剂治疗的切断轴突中Tuj1 AFI的定量(n个>300个轴突）。G公司，Axon被隔离，如上所述B类，并用对照或miR-132 PNA抑制剂治疗3.5小时。拉萨1mRNA水平（归一化为β-肌动蛋白)通过qRT-PCR进行测量(n个= 5). 条形图显示为平均值±SEM*第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页< 0.001; 不另作说明，不重要(t吨测试B类,F类,G公司; Tukey's HSD的方差分析事后（post-hoc）测试电子).
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