Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor

doi:10.1016/j.cell.2013.11.030

.2013年12月19日；155(7):1596-609.

doi:10.1016/j.cell.2013.11.030。

小胶质细胞通过脑源性神经营养因子促进学习依赖性突触的形成

克里斯托弗·帕克赫斯特¹, 广阳², 叶·尼南^三, 杰弗里·萨瓦斯⁴, 约翰·耶茨（John R Yates）第三⁴, 胡安·拉法耶⁵, 芭芭拉·伦普斯特德⁶, 丹·利特曼⁷, 文彪干⁸

附属公司

¹美国纽约大学医学院神经科学与生理学系斯基尔贝尔研究所Kimmel生物与医学中心分子神经生物学项目，纽约，NY 10016。
²美国纽约州纽约市纽约大学医学院麻醉系，邮编：10016。
^三美国纽约州纽约市纽约大学医学院精神病学系，邮编10016。
⁴美国加利福尼亚州拉霍拉市斯克里普斯研究所化学生理学系，邮编92037。
⁵美国纽约大学医学院病理学系斯基尔贝尔研究所Kimmel生物与医学中心分子病理学项目，纽约，NY 10016。
⁶美国纽约州威尔康奈尔医学院医学系10065。
⁷美国纽约大学医学院病理学系斯基尔贝尔研究所Kimmel生物与医学中心分子病理学项目，纽约，NY 10016；霍华德·休斯医学院，纽约大学医学院，美国纽约州纽约市10016。
⁸美国纽约大学医学院神经科学与生理学系斯基尔贝尔研究所Kimmel生物与医学中心分子神经生物学项目。电子地址：wenbiao.gan@nyumc.org。

PMID： 24360280
预防性维修识别码：项目经理4033691
内政部： 2016年10月10日/j.cell.2013.11.030

小胶质细胞通过脑源性神经营养因子促进学习依赖性突触的形成

克里斯托弗·帕克赫斯特等。单元格. 2013.

.2013年12月19日；155（7）：1596-609。

doi:10.1016/j.cell.2013.11.030。

作者

附属公司

¹美国纽约大学医学院神经科学与生理学系斯基尔贝尔研究所Kimmel生物与医学中心分子神经生物学项目，纽约，NY 10016。
²美国纽约州纽约市纽约大学医学院麻醉系，邮编：10016。
^三美国纽约州纽约市纽约大学医学院精神病学系，邮编10016。
⁴美国加利福尼亚州拉霍拉市斯克里普斯研究所化学生理学系，邮编92037。
⁵美国纽约大学医学院病理学系斯基尔贝尔研究所Kimmel生物与医学中心分子病理学项目，纽约，NY 10016。
⁶美国纽约州纽约市威尔康奈尔医学院医学系，邮编：10065。
⁷美国纽约大学医学院病理学系斯基尔贝尔研究所Kimmel生物与医学中心分子病理学项目，纽约，NY 10016；霍华德·休斯医学院，纽约大学医学院，美国纽约州纽约市10016。
⁸美国纽约大学医学院神经科学与生理学系斯基尔贝尔研究所Kimmel生物与医学中心分子神经生物学项目。电子地址：wenbiao.gan@nyumc.org。

PMID： 24360280
预防性维修识别码：项目经理4033691
内政部： 2016年10月10日/j.cell.2013.11.030

摘要

小胶质细胞是中枢神经系统的常驻巨噬细胞，其功能在各种脑病理学中已被广泛研究。然而，小胶质细胞在大脑可塑性和功能中的生理作用尚不清楚。为了解决这个问题，我们构建了表达他莫昔芬诱导的Cre重组酶的CX3CR1（CreER）小鼠，该重组酶允许对小胶质细胞的基因功能进行特异性操作。使用CX3CR1（CreER）来驱动小胶质细胞中白喉毒素受体的表达，我们发现白喉毒素给药后，小胶质细胞可以从大脑中特异性耗竭。缺乏小胶质细胞的小鼠在多项学习任务中表现出缺陷，并且运动学习依赖性突触形成显著减少。此外，Cre依赖性从小胶质细胞中去除脑源性神经营养因子（BDNF）在很大程度上再现了小胶质细胞耗竭的影响。小胶质BDNF增加神经元原肌球蛋白相关激酶受体B磷酸化，这是突触可塑性的关键介质。总之，我们的发现揭示了小胶质细胞通过BDNF信号促进学习相关突触的形成，从而在学习和记忆中发挥重要的生理功能。

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数字

**图1。携带*CX公司_三CR1号机组^CreER公司*等位基因**
(一个)CreER-IRES-YFP在*CX公司_三CR1号机组*轨迹。(B类)Southern blot分析*阿富汗*未定位（WT）的消化基因组DNA，*CX公司_三CR1号机组^CreER公司*目标，或*CX公司_三CR1号机组^CreER公司*小鼠新霉素耐药序列缺失后。(C类)P45运动皮层冠状切片*CX公司_三CR1号机组^CreER公司*对小鼠进行EYFP、Iba1和NeuN染色。(D类)所示基因型和治疗组小鼠运动皮层的冠状切片（比例尺=100μm）。

**图2。限制Cre介导的包括小胶质细胞缺失在内的基因功能操作的策略**
(一个)CX公司_三CR1-EYFP公司⁺CD11b细胞⁺三苯氧胺治疗5或30天后，来自所示基因型小鼠的各种组织中的种群。(B类)运动皮层冠状切片*CX公司_三CR1号机组^{CreER公司/+}：R26^Ds红色/+*在三苯氧胺治疗后30天对小鼠进行EYFP和DsRed染色。(C类)流式细胞术荧光激活细胞分选（FACS）分析的定量显示CX的百分比_三CR1-EYFP公司⁺三苯氧胺治疗后5或30天，多个组织中共表达DsRed的细胞。(D类)他莫昔芬/DT给药的时间进程和分析。(E类)DT给药后指定时间点，对对照组和小胶质细胞缺失小鼠大脑中的小胶质细胞进行FACS分析。点图显示CX的总数_三CR1-EYFP公司⁺CD11b细胞⁺DAPI上的门控单元格⁻CD3（CD3）⁻CD19型⁻CD45型^整数. (F类)DT给药后一天，对照组或小胶质细胞缺失组小鼠运动皮层的冠状切片被Iba1染色。(**G公司**)CX数量_三CR1-EYFP公司⁺CD11b细胞⁺DT给药后不同时间点脑内的小胶质细胞。(**H（H）**)显示CX百分比的FACS分析_三CR1-EYFP公司⁺CD11b细胞⁺DT给药后小鼠脾脏和血液中的细胞。(我)中所示数据的量化(**H（H）**). n=每个实验条件下4只动物。数据表示为平均+/-SEM****第页<0.0001, *第页<0.05; 比例尺=100μm。另请参见图S1、S2、S3。

**图3。小胶质细胞对于学习依赖性脊柱重塑和性能改善很重要**
(一个)他莫昔芬/DT给药时间表体内在中成像*CX公司_三CR1-iDTR公司*老鼠。(B类)对照组和小胶质细胞缺失小鼠树突状棘的经颅双光子成像。实心箭头和空箭头表示在两个视图之间形成或消除的脊椎。星号表示丝状伪足。(**C–D类**)两个P19中的小胶质细胞耗竭后，运动皮层在4天内形成或消除的脊髓百分比显著降低(C类)和P30动物(*第页<0.05, **第页<0.01，n=4-6）。(E类)三苯氧胺/DT给药时间线、轮转训练和体内成像。(F类)小胶质细胞缺失的P30小鼠的运动学习相关脊柱重塑显著降低(*第页<0.05, **第页<0.01，n=4–5）。(**G公司**)小胶质细胞耗竭的P60小鼠的运动学习相关脊柱形成显著减少(**第页<0.01,n个=4–5). (**H（H）**)P30小鼠在第一次旋转木马训练期间达到的平均速度（n=6–7). (我)P60小鼠（n）在第一次旋转木马训练期间达到的平均速度=8). (J型)在一到两天的训练中，小胶质细胞缺失的小鼠与未耗尽的对照小鼠相比表现出性能改善受损(*第页<0.05，n=6-7）。(K)在一天或两天的训练中，P60小胶质细胞缺失小鼠与未耗尽的对照小鼠相比表现出性能改善受损(*第页<0.05，n=8）。(**L（左）**)回忆测试中条件刺激呈现之前（CS前）和期间（CS）对照组或小胶质细胞缺失小鼠的冻结百分比(*第页<0.05，n=8）(**M（M）**)在新物体识别试验中，小胶质细胞缺失小鼠与新物体和熟悉物体相互作用时间的辨别率显著改变(*第页<0.05，n=8）。数据表示为平均+/-SEM。另请参见图S4。

**图4。小胶质细胞缺失的大脑中突触的生化和电生理特性发生改变**
(一个)定量蛋白质组学方案，用于识别小胶质细胞耗竭后改变的中枢神经系统蛋白质。控制(n个=3）或小胶质细胞缺失(n个=3）脑匀浆与¹⁵N内标物和一起制备。然后通过LCLC-MS/MS鸟枪蛋白质组学对样品进行分析。绿点代表小胶质细胞。(B类)蛋白质组总结火山图（x轴=对数₂ *CX公司_三CR1号机组^{CreER公司/+}/CX公司_三CR1号机组^{CreER公司/+}：R26^iDTR公司/+*，y轴=−log₁₀方差分析第页值）。黑色开环：定量蛋白质，红色开环：显著改变的蛋白质，绿色填充的圆圈：具有已知突触功能的显著改变的蛋白。(C类)通过Western blot检测对照组或小胶质细胞缺失的大脑中的突触体部分，并用指示的抗体进行检测。(D类)蛋白质印迹的密度定量(C类)(*第页<0.05，n=6）。(E类)来自对照组和小胶质细胞缺失小鼠的V层锥体神经元中NMDA mEPSCs的示例。(F类)对照组（n=17个细胞）和小胶质细胞缺失小鼠的平均NMDA mEPSC频率、振幅和衰减时间(n个=17个单元格）。小胶质细胞缺失小鼠的mEPSC频率和衰减时间显著降低(第页<0.001). (**G公司**)来自对照和小胶质细胞缺失小鼠的V层锥体神经元中AMPA mEPSCs的示例。(**H（H）**)对照组（n=9个细胞）和小胶质细胞缺失小鼠（n=8个细胞）的平均mEPSC频率、振幅和衰减时间。小胶质细胞缺失小鼠的mEPSC频率显著降低(第页<0.05). 数据表示为平均+/-SEM。另见表S1。

**图5。小胶质细胞BDNF的缺失导致突触蛋白水平的改变、突触结构可塑性的改变以及学习后的表现改善**
(一个)基于PCR的野生型（BDNF）分析^重量)，条件未删除（BDNF^弗洛克斯)，或条件删除（BDNF^Δ)CX的BDNF等位基因_三CR1-EYFP公司⁻和CX_三CR1-EYFP公司⁺从CNS中分选的细胞*CX公司_三CR1号机组^{CreER公司/+}：BDNF^{弗洛克斯/+}*或*CX公司_三CR1号机组^{CreER公司/+}：BDNF^{flox/flox公司}*三苯氧胺治疗后。(B类)定量实时PCR分析*BDNF公司*从CX中分离的mRNA_三CR1-EYFP公司⁺小胶质细胞纯化自*BDNF公司^{弗洛克斯/+}*或*BDNF公司^{flox/flox公司}*老鼠(**第页<0.01，n=3）。(C类)大脑皮层或海马中BDNF总量的平均蛋白水平*CX公司_三CR1号机组^{CreER公司/+}：BDNF^{弗洛克斯/+}*或*CX公司_三CR1号机组^{CreER公司/+}：BDNF^{flox/flox公司}*ELISA测定小鼠（n=4）。(D类)大脑的突触体部分*CX公司_三CR1号机组^{CreER公司/+}：BDNF^{弗洛克斯/+}*或*CX公司_三CR1号机组^{CreER公司/+}：BDNF^{flox/flox公司}*用指示的抗体探测小鼠。(E类)蛋白质印迹的密度定量(D类) (*第页<0.05，n=6）。(F类)Thy1 YFP小鼠树突状棘的经颅双光子成像*CX公司_三CR1号机组^{CreER公司/+}：BDNF^{弗洛克斯/+}*或*CX公司_三CR1号机组^{CreER公司/+}：BDNF^{flox/flox公司}*旋翼训练前后的小鼠。实心箭头和空箭头表示在两个视图之间形成或消除的脊椎。星号表示丝状伪足。比例尺=2μm。(**G公司**)在2天的训练中，运动皮层中现有棘被消除或新棘形成的百分比*BDNF公司^{弗洛克斯/+}*或*BDNF公司^{flox/flox公司}*老鼠(***第页<0.001，n=4）。(**H（H）**)第一次旋转木马训练期间达到的平均速度（n=5–7). (我)在1或2天的旋转训练中，运动学习任务的表现提高(*第页<0.05，误差条=扫描电镜，n=5–7）。(J型)控制中的冻结百分比*CX公司_三CR1号机组^{CreER公司/+}：BDNF^{弗洛克斯/+}*或*CX公司_三CR1号机组^{CreER公司/+}：BDNF^{flox/flox公司}*小鼠在回忆测试中呈现条件刺激之前（CS前）和期间（CS）(*第页<0.05，n=6-7）(K)在缺乏小胶质细胞BDNF的小鼠中，在新物体识别试验中与新物体和熟悉物体相互作用的时间辨别率显著改变(*第页<0.05，n=8）。数据表示为平均+/-SEM。另请参见图S5。

**图6。小胶质细胞产生前BDNF和成熟BDNF以磷酸化神经元TrkB**
(一个)从BDNF-HA或WT动物的P1小鼠培养神经元或小胶质细胞。用兔抗HA抗体免疫沉淀细胞裂解物或培养基（IP）。用HA第二抗体（小鼠HA1.1）免疫印迹法检测Pro-BDNF和成熟BDNF。(B类)p-TrkB的西联合体*CX公司_三CR1号机组^{CreER公司/+}：BDNF^{弗洛克斯/+}*或*CX公司_三CR1号机组^{CreER公司/+}：BDNF^{flox/flox公司}*老鼠(*第页<0.05，n=6）。(C类)按指示处理的DIV 8处E18大鼠神经元的代表性免疫印迹。(D类)中p-TrkB蛋白质印迹的密度定量(C类) (*第页<0.05, **第页<0.005,n个=9). 数据表示为平均+/-SEM。另请参见图S6。

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中的注释

突触可塑性：小胶质细胞的突触作用。
Welberg L。韦尔伯格L。 Nat Rev神经科学。2014年2月；15（2）：69。doi:10.1038/nrn3678。Epub 2014年1月17日。 Nat Rev神经科学。2014 PMID：24434913 没有可用的摘要。

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Zhou K、Han J、Lund H、Boggavarapu NR、Lauschke VM、Goto S、Cheng H、Wang Y、Tachi A、Xie C、Zhu K、Sun Y、Osman AM、Liang D、Han W、Gemzell-Danielsson K、Betsholtz C、Zhang XM、Zhug C、Enge M、Joseph B、Harris RA、Blomgren K。 Zhou K等。神经炎杂志。2022年1月21日；19(1):20. doi:10.1186/s12974-022-02381-6。神经炎杂志。2022 PMID：35062962 免费PMC文章。
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血管性痴呆的BDNF信号转导及其对脑血管功能障碍、突触可塑性和胆碱能系统异常的影响。
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1. Ajami B、Bennett JL、Krieger C、Tetzlaff W、Rossi FMV。局部自我更新可以维持中枢神经系统小胶质细胞在整个成年期的维持和功能。自然神经科学。2007;10:1538–1543.-公共医学
1. Bailey CH，Kandel ER。伴随记忆存储的结构变化。《生理学年鉴》。1993;55:397–426。-公共医学
1. Balkowiec A，Katz DM。ELISA原位检测初级感觉神经元内源性脑源性神经营养因子的活性依赖性释放。神经科学杂志。2000;20:7417–7423.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Bevins RA，Besheer J.大鼠和小鼠的物体识别：一项研究“识别记忆”的非匹配样本学习任务。自然协议。2006;1:1306–1311.-公共医学
1. Buch T、Heppner FL、Tertilt C、Heinen TJAJ、Kremer M、Wunderlich FT、Jung S、Waisman A.注射毒素后，Cre诱导的白喉毒素受体介导细胞系消融。Nat Meth公司。2005;2:419–426.-公共医学

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[2] Ajami B、Bennett JL、Krieger C、Tetzlaff W、Rossi FMV。局部自我更新可以维持中枢神经系统小胶质细胞在整个成年期的维持和功能。自然神经科学。2007;10:1538–1543.-公共医学

[3] Bailey CH，Kandel ER。伴随记忆存储的结构变化。《生理学年鉴》。1993;55:397–426。-公共医学

[4] Bailey CH，Kandel ER。伴随记忆存储的结构变化。《生理学年鉴》。1993;55:397–426。-公共医学

[5] Balkowiec A，Katz DM。ELISA原位检测初级感觉神经元内源性脑源性神经营养因子的活性依赖性释放。神经科学杂志。2000;20:7417–7423.-项目管理咨询公司-公共医学

[6] Balkowiec A，Katz DM。ELISA原位检测初级感觉神经元内源性脑源性神经营养因子的活性依赖性释放。神经科学杂志。2000;20:7417–7423.-项目管理咨询公司-公共医学

[7] Bevins RA，Besheer J.大鼠和小鼠的物体识别：一项研究“识别记忆”的非匹配样本学习任务。自然协议。2006;1:1306–1311.-公共医学

[8] Bevins RA，Besheer J.大鼠和小鼠的物体识别：一项研究“识别记忆”的非匹配样本学习任务。自然协议。2006;1:1306–1311.-公共医学

[9] Buch T、Heppner FL、Tertilt C、Heinen TJAJ、Kremer M、Wunderlich FT、Jung S、Waisman A.注射毒素后，Cre诱导的白喉毒素受体介导细胞系消融。Nat Meth公司。2005;2:419–426.-公共医学

[10] Buch T、Heppner FL、Tertilt C、Heinen TJAJ、Kremer M、Wunderlich FT、Jung S、Waisman A.注射毒素后，Cre诱导的白喉毒素受体介导细胞系消融。Nat Meth公司。2005;2:419–426.-公共医学

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