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.2013:4:2935.
doi:10.1038/ncomms3935。

肿瘤相关突变体p53驱动Warburg效应

岑章 1, 刘娟（Juan Liu） 1, 梁英建 2, 吴锐（Rui Wu） 三, 赵玉涵 4, 薛慧红（Xuehui Hong） 5, 梅花林 三, 余海阳 4, 刘连新 6, 阿诺德·莱文 7, 胡文伟（Wenwei Hu） 4, 冯朝晖 三
附属公司

肿瘤相关突变体p53驱动Warburg效应

岑章等。 国家公社. 2013.

摘要

肿瘤细胞主要利用有氧糖酵解产生能量，这种现象称为Warburg效应。其机制尚不清楚。肿瘤抑制基因p53在肿瘤中经常发生突变。许多肿瘤相关突变体p53（mutp53）蛋白不仅失去了肿瘤抑制功能，还获得了独立于野生型p53的新致癌功能，即mutp53-功能获得（GOF）。在这里，我们显示肿瘤相关mutp53作为一种新的mutp53-GOF刺激了培养细胞和mutp35敲除小鼠中的Warburg效应。Mutp53通过促进GLUT1易位到质膜来刺激Warburg效应，这是由激活的RhoA及其下游效应器ROCK介导的。抑制RhoA/ROCK/GLUT1信号在很大程度上消除了mutp53 GOF刺激Warburg效应。此外，抑制肿瘤细胞中的糖酵解大大削弱了mutp53 GOF促进肿瘤发生的作用。因此，我们的结果揭示了一种新的mutp53 GOF和控制Warburg效应的机制。

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利益冲突

作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

图1
图1。Mutp53在体内外均能刺激Warburg效应
（a）在p53缺失的H1299细胞中，R175H、R248Q和R273H突变p53的异位表达增强了葡萄糖摄取、糖酵解速率和乳酸生成。反对：控制。a–d中的左侧面板：通过蛋白质印迹分析检测细胞中mutp53的表达。（b）在表达R175H mutp53的SK-BR3细胞和表达R273H mutp53的MDA-MB468细胞中，两种不同的shRNA载体敲除内源性mutp5可降低葡萄糖摄取、糖酵解率和乳酸生成。Con-shR：对照shRNA；p53-shR:p53 shRNA。（c）增加葡萄糖摄取、糖酵解率和乳酸生成第53页R172H/R172HMEF与第53页−/−MEF。172:第53页R172H/R172H（d）不同组织葡萄糖摄取增加第53页R172H/R172H小鼠与p53−/−小鼠相比。（e）血清乳酸水平升高第53页R172H/R172H小鼠与p53−/−小鼠进行比较。数据表示为平均值±SD（a-c为n=5，d&e为n=6）。##：第页<0.05; #:第页<0.01; *:第页<0.005; 双尾学生t吨-测试。
图2
图2。野生型p53抑制Warburg效应在体外和体内
（a）低水平的葡萄糖摄取、糖酵解率和乳酸生成第53页+/+MEF细胞与第53页−/−MEF电池。wtp53：野生型p53。（b）不同组织的葡萄糖摄取水平较低第53页+/+小鼠与第53页−/−小鼠。（c）血清乳酸水平较低第53页+/+小鼠与第53页−/−小鼠。（d）在人乳腺MCF7、人肺H460和A549细胞中，两种不同的shRNA载体对内源性wtp53的敲除增强了细胞中的葡萄糖摄取、糖酵解速率和乳酸生成。Con-shR：对照shRNA；p53 shR:p53 shRNA。通过蛋白质印迹分析检测细胞中a-d:wtp53表达的左侧面板。数据表示为平均值±SD（a和d的n=4，b和c的n=6）。##：第页<0.05; #:第页<0.01; *:第页<0.005; 双尾学生t吨-测试。
图3
图3。Mutp53刺激GLUT1转位到质膜在体外和中活泼地
（a）Western-blot分析检测到H1299细胞中R175H、R248Q和R273H mutp53的异位表达促进了GLUT1向质膜（PM）的移位。PM蛋白Na+/K（K）+ATP酶起到负荷控制作用，Calnexin起到PM分数的负控制作用。总计：全细胞裂解物。（b）在流式细胞术分析的H1299细胞中，Mutp53促进Myc-GLUT1易位到PM。左、中面板：细胞表面（左）和整个细胞（中）的Myc-GLUT1荧光染色图像。右侧面板：与细胞内总Myc-GLUT1水平归一化后细胞表面的相对Myc-GLUT1水平。在检测前48小时，用pLPCX-Myc-GLUT1载体或pLPCX载体（作为阴性对照）转导细胞。（c）H1299对照细胞和异位表达R175H、R248Q或R273H mutp53的细胞中Myc-GLUT1的IF染色。比例尺，10µm。（d，e）通过shRNA敲除SK-BR3和MD-MBA468细胞中的内源性mutp53可减少内源性GLUT1的易位（如Western-blot分析（d）所测），并通过流式细胞术（e）测量Myc-GLUT1向PM的易位。（f）用mutp53敲除和对照细胞对SK-BR3和MD-MBA468细胞中的Myc-GLUT1进行IF染色。比例尺，10µm。在d–f中，使用了两种针对p53的shRNA载体，并观察到类似的结果。（克，小时）R172H mutp53促进内源性GLUT1向PM的易位，Western-blot分析（g）和流式细胞术（h）分析Myc-GLUT1至PM第53页R172H/R172HMEF细胞。（i）肝组织PM内源性GLUT1水平升高第53页R172H/R172H小鼠与第53页通过Western-blot分析检测到−/−小鼠。对6只/组小鼠进行分析，其中3只/组。（j）Mutp53不促进内源性GLUT2或GLUT3在H1299或MEF细胞中的移位或表达。（k）流式细胞术分析表明，Mutp53不促进H1299和MEF细胞中Myc-GLUT2或Myc-GLUT3的PM易位。在检测前48小时用pLPCX-Myc-GLUT2或GLUT3载体转导细胞。数据以平均值±标准差（n=4）表示。*：第页<0.005; #:第页<0.01; 双尾学生t吨-测试。
图4
图4。GLUT1介导mutp53对细胞Warburg效应的刺激作用
（a）shRNA载体敲除GLUT1在很大程度上消除了R175H、R248Q和R273H mutp53对H1299细胞中Warburg效应的刺激作用。Con-shR：控制shRNA；GLUT1-shR：GLUT1 shRNA。（b）siRNA敲低GLUT1基因可消除R172H mutp53对p53中Warburg效应的刺激作用R172H/R172HMEF公司。（c）shRNA敲除GLUT1后，R175H和R273H mutp53分别对SK-BR3和MDA-MB468细胞的Warburg效应产生刺激作用。（d）shRNA敲低GLUT3并没有明显影响mutp53对H1299细胞中Warburg效应的刺激作用。H1299细胞中只有GLUT3被敲除，因为在H1299中检测不到GLUT2表达（图4j）。（e）siRNA对GLUT2或GLUT3的敲除并没有明显影响R172H突变p53对小鼠Warburg效应的刺激作用第53页R172H/R172HMEF公司。a-e中的左侧面板：通过Western-blot分析分析的细胞中GLUT1、GLUT2或GLUT3的敲除。分别针对GLUT1、2和3使用两种不同的shRNA载体或siRNA寡核苷酸，并观察到类似的结果。数据表示为平均值±SD（n=3）。#：第页<0.01; *:第页<0.005; 双尾学生t吨-测试。
图5
图5。Mutp53通过激活RhoA刺激Warburg效应
（a）Mutp53增强了RhoA活性，表现为细胞中RhoA-GTP水平增加。上部面板：表示Western-blot分析的结果。下面板：单元格中相对RhoA-GTP/总RhoA水平。数据表示为平均值±SD（n=4）。（b）表达载体异位表达RhoA促进了H1299和H1299中Myc-GLUT1向PM的易位第53页−/−MEF电池。（c）RhoA的异位表达促进了H1299和第53页−/−MEF电池。（d）shRNA或siRNA对RhoA的敲除在很大程度上消除了mutp53对H1299、MEF和MDA-MB468细胞内源性GLUT1易位到PM的刺激作用。（e、f、g）RhoA敲除基本上消除了mutp53对H1299（e）、MDA-MB468（f）和MEF（g）细胞中Myc-GLUT1易位到PM的刺激作用。（h，i，j）RhoA敲除基本上消除了R273H mutp53对H1299（h）、MDA-MB468（i）和MEF细胞（j）中Warburg效应的刺激作用。在d-j中，使用了两种不同的针对RhoA的shRNA载体或siRNA寡聚体，并观察到类似的结果。数据表示为平均值±SD（n=4）。##：第页<0.05; #:第页<0.01; *:第页<0.005; 双尾学生t吨-测试。
图6
图6。Mutp53通过ROCK激活刺激Warburg效应在体外和体内
（a）酶免疫测定结果显示，Mutp53增强了H1299、MEF、SK-BR3和MD-MB468细胞中的ROCK活性。（b）ROCK抑制剂Y27632（10µM，6 h）在很大程度上消除了mutp53对H1299和MEF细胞中GLUT1易位到PM的刺激作用。PM：质膜；总量：全细胞提取物。（c、d）Y27632处理和siRNA敲低ROCK1/2在很大程度上消除了mutp53对H1299细胞中Myc-GLUT1易位到PM（c）和Warburg效应（d）的刺激作用。用pLPCX-Myc-GLUT1载体转染细胞后，在检测前24小时用siRNA寡核苷酸转染细胞，以同时敲低ROCK1/2。通过实时PCR分析证实了ROCK1/2敲除（补充图S5d）。（e、f）Y27632处理（10µM，6 h）和ROCK1/2敲除在很大程度上消除了mutp53对Myc-GLUT1易位（e）和Warburg效应（f）的刺激作用第53页R172H/R172HMEF细胞。（g）不同组织中RhoA-GTP水平升高第53页R172H/R172H小鼠与p53−/−小鼠进行比较。左侧面板：表示Western-blot分析的结果。右侧面板：相对RhoA-GTP/总RhoA水平。数据以平均值±SD表示（n=6只小鼠，重复两次）。（h）不同组织中ROCK活性增加第53页R172H/R172H小鼠与第53页−/−小鼠。（i）Y27632基本上消除了R172H mutp53对小鼠不同组织中GLUT1易位到PM的刺激作用。在注射Y27632（i.p.；10µg/g体重）后3 h处死小鼠进行分析。（j）Y27632基本上消除了R172H mutp53对小鼠不同组织葡萄糖摄取的刺激作用。在葡萄糖摄取试验前3小时，向小鼠注射Y27632（i.p.）。（k）Y27632基本上消除了R172H mutp53对小鼠血清乳酸生成的刺激作用。在c–f中，分别使用了两种不同的siRNA寡核苷酸来对抗ROCK1和ROCK2，并观察到类似的结果。在g–k中，每组使用6只小鼠进行分析。数据表示为平均值±SD（n=4 in a–f，n=6 in h，j，k）。##：第页<0.05; #:第页<0.01; *:第页<0.005; 双尾学生t吨-测试。
图7
图7。Mutp53促进肌动蛋白聚合，促进GLUT1转位到质膜
（a）Mutp53刺激肌动蛋白聚合，在表达R175H、R248Q或R273H Mutp53的H1299细胞中，RhoA shRNA和ROCK抑制剂Y27632（10µM，6小时）可以消除肌动蛋白的聚合。（b）肌动蛋白聚合抑制剂，细胞松弛素D（Cyto D）和latrunculin B（Lat B），消除了mutp53对H1299细胞肌动蛋白聚集的促进作用。（c、d）Cyto D和Lat B阻断了mutp53对H1299细胞内源性GLUT1（c）和Myc-GLUT（D）向质膜（PM）移位的刺激作用。总量：全细胞提取物。（e）细胞D和Lat B在H1299细胞中消除了mutp53对Warburg效应的刺激作用。（f）Mutp53促进肌动蛋白聚合第53页R172H/R172HMEFs，可以被Cyto D废除。（克，小时）Cyto D和Lat B消除了mutp53对Myc-GLUT1易位到PM（g）的刺激作用和Warburg效应（h）第53页R172H/R172HMEF公司。（i）敲除R273H mutp53可减少MDA-MB468细胞中肌动蛋白聚合，而细胞D可消除肌动蛋白的聚合。（j，k）Cyto D和Lat B在MDA-MB468细胞中消除了mutp53对Myc-GLUT1易位到PM（j）的刺激作用和Warburg效应（k）。在分析之前，用（+）或不用（−）Cyto D（20µM）或Lat B（10µM。对照组（Con）用二甲基亚砜治疗。数据表示为平均值±SD（n=3）。#：第页<0.05; *:第页<0.005; 双尾学生t检验。
图8
图8。糖酵解抑制对肿瘤发生中mutp53 GOF的影响
（a）shRNA载体（GLUT1-shR或RhoA-shR）对GLUT1或RhoA的敲除在很大程度上消除了R175H、R248Q和R273H mutp53对H1299细胞中锚定非依赖性生长的促进作用。左侧面板：表示H1299细胞中R175H mutp53表达和对照细胞中软琼脂上的菌落图像。比例尺，100µm。（b）shRNA载体对GLUT1或RhoA的敲除在很大程度上消除了R273H mutp53对MDA-MB468细胞中凤尾鱼非依赖性生长的促进作用。（c、d）shRNA对GLUT1（c）或RhoA（d）的敲除在很大程度上消除了R175H mutp53对H1299细胞异种移植瘤生长的促进作用。左侧面板：表示第24天的肿瘤图像。右侧面板：异种移植瘤的生长曲线。（e）shRNA敲除GLUT1（左）或RhoA（右）在很大程度上消除了R273H mutp53对H1299细胞异种移植瘤生长的促进作用。（f）shRNA对GLUT1（左）或RhoA（右）的敲除在很大程度上消除了R273H mutp53对MDA-MB468细胞异种移植瘤生长的促进作用。（克，小时）在含有半乳糖但不含葡萄糖的培养基中培养细胞消除了突变p53对H1299（g）和MDA-MB468（h）细胞中锚定非依赖性生长的促进作用。左侧面板（g）：表示H1299细胞中R175H mutp53表达和对照细胞中软琼脂上的菌落图像。比例尺，100µm。（i）显示Warburg效应作为突变p53的新GOF的刺激的模型。在a–h内，针对每个靶基因的两种不同shRNA载体，包括GLUT1、RhoA和p53，用于所有检测，并且观察到类似的结果。数据表示为平均值±SD（c–f的n=10，其余的n=4）。*：第页<0.005; #:第页<0.01; 双尾学生t吨-测试a、b、g和h；方差分析，然后是学生的t吨–c–f测试。
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