L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation

doi:10.1016/j.stemcr.2013.09.001

.2013年10月10日；1(4):307-21.

doi:10.1016/j.stemcr.2013.09.001。 2013年电子收集。

L-脯氨酸通过重塑H3K9和H3K36甲基化在胚胎干细胞中诱导间质样侵袭程序

斯蒂芬妮娅来了¹, 米里亚姆·加利亚迪, 尼古拉·拉普拉诺, 安娜丽莎·菲科, 阿米莉亚·西米诺, 安德烈亚·帕拉米德斯, 达里奥·德·塞萨尔, 桑德罗·德·法尔科, 克劳迪娅·安吉利尼, 乔治·西塔, 爱德华多·J·帕特里亚卡, 玛丽亚·R·马塔拉佐, 加布里埃拉·明奇奥蒂

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附属

¹遗传和生物物理研究所干细胞命运实验室，“A.Buzzati-Traverso”，CNR，80131 Naples，意大利；遗传和生物物理研究所“A.Buzzati-Traverso”，CNR，意大利那不勒斯80131号。

PMID： 24319666
预防性维修识别码：项目经理3849245
内政部： 2016年10月10日/j.stemcr.2013.09.001

L-脯氨酸通过重塑H3K9和H3K36甲基化在胚胎干细胞中诱导间质样侵袭程序

斯蒂芬妮娅来了等。干细胞报告. 2013.

.2013年10月10日；1(4):307-21.

doi:10.1016/j.stemcr.2013.09.001。 2013年电子收集。

作者

附属

¹遗传和生物物理研究所干细胞命运实验室，“A.Buzzati-Traverso”，CNR，80131 Naples，意大利；遗传和生物物理研究所“A.Buzzati-Traverso”，CNR，意大利那不勒斯80131号。

PMID： 24319666
预防性维修识别码：项目经理3849245
内政部： 2016年10月10日/j.stemcr.2013.09.001

摘要

代谢物正在成为新陈代谢流量、细胞信号传递和细胞命运表观遗传调控之间相互干扰的关键介质。我们发现，非必需氨基酸L-脯氨酸（L-Pro）作为一种信号分子，促进胚胎干细胞转化为间质样、纺锤状、高运动性、侵袭性多能干细胞。这种胚胎-胚胎-细胞-间充质样转变（esMT）伴随着H3K9和H3K36甲基化状态的全基因组重塑。一贯地，L-Pro-induced esMT在L-Pro退出或添加抗坏血酸（维生素C）后是完全可逆的，这反过来降低了H3K9和H3K36甲基化，促进了间质样-胚胎-干细胞转变（MesT）。这些发现表明，由细胞外基质蛋白水解酶重构产生的L-Pro可能作为微环境线索来控制干细胞行为。

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图1
L-Pro诱导ESCs中的细胞骨架重排和细胞运动（A和B）结晶紫（A）和Phalloidin TRITC（B）染色的PiC和ESC集落的代表性显微照片。收缩纤维(^∗)和前缘跛足（箭头）显示（A）。细胞核用Hoechst染色。（B）比例尺代表100μm。（C）标记有vinculin和phalloidin（上面板）或β-微管蛋白（下面板）的ESCs/PiCs的荧光共焦显微照片。肌动蛋白应激纤维用磷脂酶-TRITC标记（红色；[B和C]）。微管和局部粘连用抗β-微管蛋白（绿色；[C]，下面板）和抗Vinculin（绿色；[C]，上面板）抗体染色。细胞核用TO-PRO-3复染。比例尺代表50μm。（D）未处理（对照）和L-预处理ESC的延时序列的代表帧。从第3天开始拍摄图像（20×）。（E）在15%的FBS中迁移的ESC/PiC的平均数量（10.5±1.5 ESC对33±3 PiC）或向FBS梯度1%–15%的方向迁移（13±2 ESC对110±13 PiC）。（F）在1%FBS中单独（对照组）或向EGF（50 ng/ml）、胰岛素（5μg/ml）、SDF-1（100 ng/ml）或Cyr61（200 ng/ml。数据为平均值±SD（n=3）；^∗p<0.01；^∗∗p<0.005。另请参见图S1和电影S1、S2和S3。

图2
L-Pro重塑PiCs与ESCs差异表达基因的ESC转录组（A）热图。（B）显示差异表达式大小的火山图[log₂（折叠变化），x轴]与统计显著性测量值[−log₁₀（p值），y轴]。差异表达量≥5倍的基因用红色表示。（C）基因本体（GO）分析(网址：http://david.abcc.ncfcrf.gov). 饼图显示了微阵列分析中最具代表性的GO术语，比较了PiC和ESC。每个饼片内的数字显示了每种类别中差异表达蛋白编码基因的分数（%）（表S1）。（D）描述PiCs与EpiSCs差异表达基因之间重叠的文氏图或*Klf2型*/*四氟化钾/五氟化钾*(*Klf2,4,5*)三次击倒ESC与对照ESC相比。（E） KEGG途径富集分析；与细胞骨架/细胞运动/粘附或癌症相关的通路分别以绿色和蓝色突出显示。另请参见图S2和表S1。

图3
L-脯氨酸处理的ESCs的侵袭和转移潜能（A）平行迁移（灰色条）和细胞侵袭（黑色条）跨阱分析，测量ESCs和PiC向FBS梯度（1%–15%）±SDF-1（100 ng/ml）的迁移/侵袭。指出了迁移和入侵的PiCs的平均数量。数据为平均值±SD；n=3；^∗p<0.05；^∗∗p<0.001。（B）体内转移试验示意图。非肥胖糖尿病（NOD）/SCID小鼠静脉注射EGFP标记的ESCs、PiCs（1×10⁶或B16-BL6黑色素瘤细胞（2×10⁵). （C） ESC/PiC注射小鼠的肺（左图）和苏木精和伊红染色的肺组织切片（右图），显示两只PiC注射小鼠出现大畸胎瘤；n=5/组。（D）显示EGFP的肺组织切片的代表性显微照片⁺PiC衍生的畸胎瘤（白星，上图）或B16-BL6黑色素瘤细胞衍生肿瘤用作对照（白星图，下图）。比例尺代表100μm（C）和500μm（D）。另请参见图S3。

图4
L-Pro诱导对经L-Pro-治疗的与未经治疗的ESCs（第5天）中EMT标记的表达进行esMT（A）qPCR分析。（B和C）*N-计算机辅助设计*和T型通过qPCR（B）和western blot（C）分析测定表达。GAPDH，3-磷酸甘油醛脱氢酶。（D）的缩微照片T型PIC的免疫染色（左侧面板）和相位对比（右侧面板）。比例尺代表100μm。（E） qPCR分析*电子cad*,蜗牛、和鼻塞L-Pro-treated与未处理ESCs的表达（第5天）。（F） western blot分析L-Pro-treated ESCs中E-CAD表达的时间进程。GAPDH归一化后与未处理ESC相关的E-CAD蛋白水平的密度分析。（G）使用常规（上面板）或共焦（下面板）荧光显微镜对对照组和L-脯氨酸处理的ESC进行E-CAD免疫染色的图像。白色箭头（插图）表示E-CAD的囊泡核周定位。比例尺代表50μm。（H）荧光共焦显微照片显示E-CAD与高尔基体标记GM130的共定位（白色箭头）。用Hoechst对细胞核进行复染。比例尺代表20μm。（一）时间进程*Pkdcc公司*通过qPCR在L-前处理的ESCs中表达。（A、B、E和I）。与控制ESC相比，数据在归一化至*Gapdh公司*（J）下调*Pkdcc公司*左图显示L-Pro-treated ESCs中siRNAs的表达（第5天）。数据是基因表达与对照（非靶向siRNA）相比的翻倍变化。的影响*Pkdcc公司*-群体型频率的沉默（右图）；数据为平均值±标准偏差，～100个菌落得分；n=3；^∗p<0.01。另请参见图S4。

图5
与ESC相比，L-Pro修改了PiC中H3K9单甲基化、二甲基化和三甲基化（左）以及H3K4、K27和K36三甲基化水平的ESCs（A）的表观基因组特征Western blot分析。密度分析与对照组蛋白H3归一化后的ESCs相关。数据为平均值±SD（n=3）；^∗p<0.05；^∗∗p<0.001。（B） PiCs与ESCs基因和基因间区域H3K9me3结合位点的全基因组H3K9 me3峰（上面板）和基于SICER的差异分布（下面板）。（C）维恩图关联微阵列基因表达和ChIP-seq数据（p=0.03；Fisher精确检验；上部面板）。对H3K9me3差异富集和非调控的439个位点进行KEGG途径富集分析（下表）。（D） H3K9me3配置文件快照*涂抹1*,*Apod公司*、和*Ceacam1号机组*基因。（E） PiCs与ESCs基因和基因间区域差异H3K36me3结合位点的全基因组H3K365me3峰（上面板）和基于SICER的分布（下面板）。（F）维恩图关联微阵列基因表达和ChIP-seq数据（p=0.03；Fisher精确检验；上面板）以及628个H3K36me3差异富集和非调控位点的KEGG通路富集分析（下面板）。（G） H3K36me3配置文件快照*坑x2*,*Fgf5型*、和*Pkdcc公司*基因。另请参见图S5和表S2。

图6
维生素C恢复诱导H3K9和H3K36去甲基化的PiC表型（A）实验策略示意图。新生成的PIC（P₀)两次传代（P₁和P₂)含L-Pro（对照）、不含L-Pro或含L-Pro+VitC。然后将细胞以500个细胞/厘米的速度接种²，生长5天，进行菌落表型分析（圆顶与扁平；右侧面板）。数据表示菌落类型频率的百分比，平均值为±SD；～100个菌落得分；n=3。（B） ESCs、PiCs和维生素C处理的PiCs（ESCs）的迁移（白色条）和细胞侵袭（灰色条）跨阱分析^利润)朝向FBS梯度（1%–15%）。显示了迁移和入侵细胞的平均数量。数据为平均值±SD；n=3；^∗p<0.01；^∗∗p<0.0001。ESCs中L-Pro-induced表型转变的（C和D）比较分析^利润和ESC。（C）对照组（未经处理）和L-预处理ESC和ESC的平板菌落频率^利润电镀后第4天和第5天。数据为平均值±标准偏差（n=3；每个实验中对100个菌落进行评分）。（D） L-Pro-treated ESCs与ESCs中PiC形成的时间进程分析^利润.结晶紫染色、L-预处理ESC和ESC的代表性显微照片^利润在指定时间点的菌落。比例尺代表50μm。（E） qPCR分析T型和*英赫布*表达式。数据是与对照组（+L-Pro）相比，在标准化至*Gapdh公司*（F）H3K9me3和H3K36me3水平的蛋白质印迹分析（下面板）。密度分析（上图）是相对于总组蛋白H3标准化后的对照ESCs。数据为平均值±SD（n=2）；^∗p<0.05；^∗∗p<0.01。另请参见图S6。

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