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。2013年12月4日；33（49）：19086-98。
doi:10.1523/JNEUROSCI.2508-13.2013。

药物抑制ROCK2抑制阿尔茨海默病小鼠模型中淀粉样β的生成

杰里米·赫斯科维茨 1, 杨伯峰, Alexa L Mattheyses公司, 查德威克·M·哈尔斯, 莱诺拉·希金波坦, Duc M Duong公司, 托马斯·蒙廷, 胡安·特隆科索, Madhav Thambisetty公司, 尼古拉斯·塞弗里德, 艾伦·利维, 詹姆斯·拉赫
附属公司

药物抑制ROCK2抑制阿尔茨海默病小鼠模型中淀粉样β的生成

杰里米·赫斯科维茨等。 神经科学。 。

摘要

阿尔茨海默病（AD）是痴呆症的主要病因，无法治愈。遗传、细胞生物学和生物化学研究表明，减少淀粉样蛋白-β（Aβ）的产生可能是延缓或预防AD进展的合理治疗途径。抑制Rho GTPase家族成员RhoA被提议抑制aβ的产生。然而，这一假设的障碍是对RhoA、Rho相关的、含有线圈的蛋白激酶（ROCK）1和ROCK2的主要下游效应器如何调节aβ生成的了解有限。在这里，我们报告说，ROCK1基因敲除增加了内源性人类Aβ的产生，而ROCK2基因敲除则降低了Aβ的水平。使用同种型选择性小分子（SR3677）抑制ROCK2激酶活性，抑制AD小鼠大脑中β-位点APP裂解酶1（BACE1）的酶促作用并减少Aβ的产生。免疫荧光和共聚焦显微镜分析显示，SR3677改变了BACE1的内吞分布，并促进淀粉样前体蛋白（APP）向溶酶体的运输。此外，SR3677还阻断了苏氨酸654（T654）处APP的ROCK2磷酸化；在神经元中，T654对APP处理为Aβ至关重要。这些观察结果表明，ROCK2抑制通过独立机制降低Aβ水平。最后，无症状AD、轻度认知功能障碍和AD脑中ROCK2蛋白水平升高，表明ROCK2水平在AD早期阶段发生变化，并在整个疾病进展过程中保持升高。总之，这些发现强调了ROCK2是一种基于机制的治疗靶点，可以对抗AD中aβ的生成。

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数字

图1。
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Aβ水平在ROCK1击倒后升高，但在ROCK2击倒后降低。A类将人SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞暴露于RhoI、Y-27632或载体（Mock），用ELISA法检测分泌内源性Aβ40。与模拟相比，RhoI或Y-27632降低了Aβ40 12%***第页< 0.0001.B类，SH-SY5Y细胞被表达ROCK1-、ROCK2-或scrams-shRNA的慢病毒转导，并测量APP、sAPPα和Aβ40（显示代表性印迹）。ROCK2敲除降低内源性APP和sAPPα（分别为20%和32%）*第页= 0.032, **第页= 0.0037.C类ROCK1或ROCK2敲除细胞的Aβ40分别增加65%和减少50%***第页< 0.0001.D类，使用第二组shRNA序列，ROCK1或ROCK2敲除对人类内源性Aβ水平的影响。用表达交替ROCK1-、ROCK2-或干扰shRNA序列的质粒转染HEK293细胞，转染后96 h用ELISA测定分泌的内源性Aβ40。代表性免疫印迹证实shRNA介导的ROCK1或ROCK2基因敲除。与shRNA实验一致B类和C类ROCK1敲除使Aβ40水平增加16%，而ROCK2敲除使Bβ40水平降低22%***第页< 0.0001.E类、ROCK1和ROCK2 shRNA-resistant突变体对ROCK1或ROCK2 RNAi缺失后内源性Aβ水平的拯救作用。用表达ROCK1-、ROCK2-或scram-shRNA的慢病毒转染SH-SY5Y细胞，然后分别用表达ROCK1 shRNA-resistant突变体（R1拯救）、ROCK2 shRNA-resistant突变（R2拯救）或空载体的质粒转染。转染48小时后，用ELISA检测分泌的内源性Aβ40。代表性免疫印迹证实shRNA介导的ROCK1或ROCK2的敲除，以及R1和R2的拯救表达。Aβ40水平在打乱、R1救援和R2救援样本中具有可比性（SCR:99%；R1 shRNA:120%；R1救援：94%；R1 sh RNA vs R1救援*第页= 0.02; R2 shRNA：67%；R2救援：103%；R2 shRNA vs R2救援*第页= 0.0204). M、 模拟；SCR，加扰。N个=每种条件下3–6次生物复制。所有数据均表示为模拟或加扰控制的平均值±SEM的百分比。
图2。
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SR3677以剂量依赖性方式降低sAPPβ和Aβ。A类，用表达APP的慢病毒转导神经元695并暴露于RhoI，Y-27632（Y-27，50μ米)，SR3677（50μ米)，或H2O（模拟）。SR3677分别降低Aβ40和Aβ42水平76%和78%***第页< 0.0001.B类将人SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞暴露于SR3677（50μ米)或车辆（H2O、 标记mock），并用ELISA测定分泌的内源性Aβ40。与模拟相比，SR3677治疗使Aβ40降低68%***第页< 0.0001.C类，表达APP的神经元695以指定剂量暴露于SR3677，并测量APP、sAPPα和sAPPβ（显示代表性印迹）。密度分析表明，当浓度≥20μ米（APP:20μ米, 58%; 40 μ米, 48%; 60 μ米，46%；sAPPα：20μ米, 67%; 40 μ米, 65%; 60 μ米, 57%; APP：模拟与20、40或60μ米, ***第页< 0.001; sAPPα：模拟vs 20 40或60μ米, *第页≥ 0.01). sAPPβ的减少呈剂量依赖性（sAPP？：模拟，100%；5μ米, 74%; 10 μ米, 40%; 20 μ米, 26%; 40 μ米, 21%; 60 μ米, 8%; 模拟与10μ米, *第页= 0.0341; 模拟vs 20μ米, *第页= 0.0138; 模拟vs 40μ米, *第页= 0.013; 模拟与60μ米, **第页= 0.0089).D类，密度分析C类用于计算sAPPα与APP的比值。在较高浓度的SR3677下，sAPPα与APP的比值增加。E类，表达APP的神经元695以指定剂量接触SR3677或Fasudil，并用ELISA测定Aβ40。SR3677以剂量依赖的方式降低Aβ40（模拟，100%；5μ米, 88%; 10 μ米, 70%; 20 μ米，56%；40 μ米, 43%; 60 μ米, 26%; 模拟vs 5μ米, **第页= 0.0088; 5μvs 10μ米, ***第页= 0.0001; 10μvs 20μ米, ***第页< 0.0001; 20μvs 40μ米, **第页= 0.0016; 40μvs 60μ米, *第页= 0.0301). 当剂量≥20μ米（模拟，100%；5μ米, 107%; 10 μ米, 99%; 20 μ米, 83%; 40 μ米, 81%; 60 μ米, 78%; 模拟vs 20μ米, *第页= 0.0151; 模拟vs 40μ米, **第页= 0.0092; 模拟与60μ米, **第页= 0.0022).F类，将小鼠初级皮层神经元暴露于载体（H2O、 标记的模拟）或指示剂量的SR3677持续16小时。吉为了验证SR3677能够降低神经元中ROCK2激酶的活性，用SR3677（20μ米)或载体（模拟），16小时后收获，通过免疫印迹检测肌球蛋白轻链2丝氨酸19（pMLC-Ser19）的磷酸化，即ROCK2底物（Totsukawa等人，2000年）。吉伊同时，用慢病毒转导神经元，驱动ROCK2靶向或干扰shRNA的表达，96小时后收获神经元。使用针对Ser19的磷酸特异性抗体进行的免疫印迹分析显示，暴露于SR3677或ROCK2的RNAi缺失类似地降低了pMLC-Ser19的水平，支持SR3677抑制神经元中的ROCK2激酶活性。肌动蛋白用作负载控制。M、 模拟；SCR，加扰。N个=每种条件下3–6次生物复制。所有数据均表示为相对于模拟的平均值±SEM的百分比。
图3。
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SR3677降低5XFAD小鼠大脑中的Aβ。SR3677或H2将O（mock）立体定向注射到5XFAD小鼠脑内。在左右半球进行注射。每个大脑半球被分别处理，左右半球的分析测量值被平均化，以得出每个大脑的一个数据点（每个条件四只小鼠）。注射后24小时，准备脑匀浆进行生化分析。A类，显示代表性免疫印迹。注射SR3677的脑内APP和sAPPβ与模拟相比分别减少32%和77%***第页= 0.001, **第页= 0.0036.B类与模拟大脑相比，注射SR3677的大脑中Aβ40和Aβ42的水平分别降低了53%和33%***第页< 0.0001, *第页= 0.0105. 所有数据均表示为相对于模拟的平均值±SEM的百分比。
图4。
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SR3677抑制5XFAD小鼠大脑中的BACE1酶活性。A类根据荧光单位测量，药物治疗小鼠的BACE1活性降低了～31%。B类，重组BACE1蛋白与H孵育2O、 SR3677或BI IV，并测量酶活性。C类，SH-SY5Y细胞暴露于增加剂量的SR3677，并测量BACE1活性。浓度≥10μ时米BACE1活性显著降低（模拟与10μ米, **第页= 0.0063; 模拟vs 20、40或60μ米, ***第页< 0.002; 10μvs 20μ米, *第页= 0.0281).D类BACE1肽与重组ROCK2蛋白±SR3677孵育，并通过LC-MS/MS进行检测。具有代表性的BACE1 S498磷酸肽谱显示前体中性丢失峰。E类，S498磷酸肽的代表性提取离子色谱图（使用定义的前体质量容限测量为百分比强度）。x个-轴表示获得MS/MS光谱的时间。将肽强度归一化为含有ROCK2蛋白但不含SR3677的样品。F类，用BACE1或BACE1S498A转染SH-SY5Y细胞，24h后检测酶活性。与BACE1相比，表达BACE1S498A的细胞的酶活性降低了20%***第页< 0.0001. 代表性免疫印迹显示BACE1和BACE1S498A的表达水平。M、 模拟；SR，SR3677。N个=每种条件下4–6次生物复制。所有数据均表示为相对于模拟的平均值±SEM的百分比。
图5。
图5。
SR3677促进BACE1和APP向溶酶体的流量。用表达BACE1的质粒转染HEK293细胞。用50μg的药物治疗6小时后，评估BACE1与以下细胞器标记物的共定位：EEA1、CD63和LAMP1米SR3677。A类BACE1（红色）和细胞器标记（绿色）的代表性图像以及共定位（黄色）显示在合并和放大图像中。B类合并和放大图像中显示了内源性APP（红色）和LAMP1（绿色）的代表性图像，以及同位化（黄色）。C类，BACE1染色的定量分析。SR3677减少了BACE1与EEA1的重叠（模拟，M2=0.5；SR3677，M2=0.2044***第页< 0.0001). SR3677增加了BACE1与CD63的共定位，但与模拟相比变化不显著（模拟，M2=0.2493；SR3677，M2=0.4499）。SR3677增加了BACE1与LAMP1的重叠（模拟，M2=0.2614；SR3677，M2=0.735***第页< 0.0001).D类，内源性APP染色定量分析。SR3677增加了APP与LAMP1的共定位（模拟，M2=0.2510；SR3677，M2=0.6501***第页< 0.0001). 数值显示为平均值±1 SD（误差条）。所示数据代表三个独立实验。比例尺：合并图像，5μm；放大图像，1μm。
图6。
图6。
ROCK2在T654磷酸化APP，而T654对神经元中Aβ的生成至关重要。此外，APP T654对丙氨酸（T654A）的突变与SR3677暴露相结合可协同降低Aβ40和Aβ42水平，表明抑制ROCK2活性通过至少两种独立机制抑制Aβ的产生。A类，APP肽与重组ROCK2蛋白±SR3677孵育，并通过LC-MS/MS进行检测。具有代表性的T654 APP磷酸肽谱显示前体中性丢失峰。B类，T654磷酸肽的代表性提取离子色谱图（使用定义的前体质量容限测量为百分比强度）。这个x个-轴表示获得MS/MS光谱的时间。将肽强度归一化为含有ROCK2蛋白但不含SR3677的样品。C类，用表达APP的慢病毒转导神经元695（WT）或T654A，以及sAPPα和sAPPβ的测定（显示代表性印迹）。密度分析表明，表达T654A的神经元sAPPβ减少了42%**第页=0.0047。D类表达T654A的神经元的Aβ40和Aβ42水平分别降低了40%和26%（Aβ40:WT vs T654A**第页= 0.0014; Aβ42:WT与T654A***第页= 0.0006; T654A:Aβ40 vs Aβ42*第页= 0.0425). SR3677（SR+）使WT表达神经元的Aβ40和Aβ42水平分别降低34%和35%。SR3677使表达T654A的神经元的Aβ40和Aβ42水平分别降低68%和59%（Aβ40:T654Avs T654A+SR*第页=0.0146；Aβ42:T654A与T654A+SR**第页= 0.0018). SR，SR3677。A类,B类，生物检测一式三份。C类,D类,N个=每种条件下3–6次生物复制，所有数据均表示为相对于对照的平均值±SEM的百分比。
图7。
图7。
人类AD大脑中ROCK2蛋白水平升高。A–C使用来自对照组（CTL）、无症状AD（aAD）、MCI或AD大脑的死后额叶皮质匀浆进行免疫印迹。每条车道装载50微克，ROCK2水平归一化为肌动蛋白。病例编号与表1中的信息相对应。D类密度分析表明，与CTL相比，aAD、MCI和AD的ROCK2分别升高了107%、28%和92%*第页= 0.0164, ***第页< 0.0009. 每种情况都表示为一个单独的数据点，直线表示平均值。E类，对照组和AD脑中ROCK2的免疫组织化学分析。ROCK2（红色）和Iba1（绿色）或GFAP（绿色）的代表性图像，合并图像中显示了Hoechst（蓝色）。比例尺，10μ米。
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参考文献

    1. Amano M、Tsumura Y、Taki K、Harada H、Mori K、Nishioka T、Kato K、Suzuki T、Nishioga Y、Iwamatsu A、Kaibuchi K。一种蛋白质组学方法，用于全面筛选Rho激酶等蛋白激酶底物。公共科学图书馆一号。2010;5:e8704。doi:10.1371/journal.pone.0008704。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Bolt S，Cordelières FP.光学显微镜亚细胞共定位分析导览。微生物学杂志。2006;224:213–232. doi:10.1111/j.1365-22818.2006.01706.x。-内政部-公共医学
    1. Citron M，Teplow DB，Selkoe DJ。从其前体产生淀粉样β蛋白具有序列特异性。神经元。1995;14:661–670. doi:10.1016/0896-6273（95）90323-2。-内政部-公共医学
    1. Cole SL，Vassar R.阿尔茨海默病β-分泌酶，BACE1。摩尔神经变性剂。2007;2点22分。doi:10.1186/1750-1326-2-22。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. De Strooper B，Vassar R，Golde T。分泌酶：在阿尔茨海默病中具有治疗潜力的酶。Nat Rev Neurol公司。2010;6:99–107. doi:10.1038/nrneul.2009.218。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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