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.2014年3月；63(3):982-93.
doi:10.2337/db13-0425。 Epub 2013年11月5日。

表皮生长因子受体信号通过mTOR和FOXM1促进大鼠胰腺β细胞增殖以应对营养过剩

巴德·扎鲁基 1, 伊斯马·本特基, Ghislaine字体, Marie-Line皮约特, 昂德雷·塞达, 马克·普伦斯基, 文森特·波伊图特
附属公司

表皮生长因子受体信号通过mTOR和FOXM1促进大鼠胰腺β细胞增殖以应对营养过剩

巴德·扎鲁基等人。 糖尿病. 2014年3月.

摘要

胰岛素抵抗导致β细胞质量代偿性增加的细胞和分子机制尚不清楚。我们之前报道，葡萄糖和脂内蛋白（GLU+IL）72小时共融合可诱导6个月大的Wistar大鼠产生胰岛素抵抗，并显著增加β细胞增殖，但在2个月大的Wistar大鼠中没有。当前研究的目的是确定该模型中营养素诱导β细胞增殖的机制。转录组学分析确定了叉头转录因子FOXM1及其靶点以及肝素结合表皮生长因子（EGF）样生长因子（HB-EGF）（EGF受体（EGFR）配体）在营养素诱导的β细胞增殖中的中心作用。核糖体S6激酶是雷帕霉素（mTOR）靶点的哺乳动物靶点，其磷酸化作用在注射GLU+IL的6月龄大鼠的胰岛中增加。HB-EGF可诱导胰岛素分泌型MIN6细胞和分离的大鼠胰岛的增殖，EGFR抑制剂AG1478或mTOR抑制剂雷帕霉素可阻断这种作用。在6个月大鼠中，AG1478或雷帕霉素的共融合阻断了FOXM1信号、β细胞增殖、β细胞质量和大小的增加，以应对GLU+IL的输注。我们的结论是，长期营养过剩通过EGFR信号、mTOR激活和FOXM1介导的细胞增殖途径促进β细胞质量扩张。

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数字

图1
图1
GLU+IL注入6个月大鼠的代谢参数。2月龄和6月龄Wistar大鼠注射SAL或GLU+IL 72小时。A–C：输液结束时的血糖、FFA和胰岛素水平(n个= 4).D类：输注期间的平均葡萄糖输注率（GIR）(n个= 11–18).E类：血浆胰高血糖素(n个= 4).F类：输注结束时分离的胰岛中Ki67 mRNA的相对表达（归一化为亲环素A mRNA，并与各年龄组SAL融合动物的水平相关；n个= 4). 数据表示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
图2
图2
GLU+IL注入6个月大鼠分离胰岛的转录组分析。A类：散点图中表示的差异表达基因。B类：由Ingenuity Pathway Analysis软件注释的顶级生物功能和标准路径（Fisher精确测试P（P）值）。C类：参与细胞周期进展的代表性基因网络，显示HB-EGF、FOXM1和FOXO3a的中心作用。上调基因以红色显示，下调基因以绿色显示。数据来自每组五只动物。
图3
图3
在注射GLU+IL的6月龄大鼠的胰岛中诱导FOXM1及其靶点的表达。A–E：qRT-PCR测量各年龄组中与亲环素A和SAL融合动物相关的mRNA表达。数据表示为每组5-11只动物的平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.F类：每个输液组中四只6个月大鼠FOXM1的代表性Western blot。
图4
图4
HB-EGF以EGFR/mTOR依赖的方式促进β细胞增殖。A类,G公司、和H（H）：用HB-EGF加或不加AG1478（300 nmol/L）或雷帕霉素（10 nmol/L.）和HB-EGF-拮抗剂CRM197（10µg/mL）处理24小时后，通过计数细胞核来测量MIN6细胞增殖。数据表示为三到六个实验的平均值±SEM*P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.001.B类：在没有或存在HB-EGF（100 ng/mL）的情况下，将分散的大鼠胰岛处理72 h，固定细胞并对其进行Ki67和PDX-1染色。β-细胞增殖以双阳性Ki67的百分比计算+/PDX-1型+总PDX-1上的细胞+人口。数据表示为四个重复实验的平均值±SEM**P（P）< 0.01. HB-EGF处理MIN6细胞后磷酸化S6R（p-S6R）的典型Western blot和密度定量(C类)和人类胰岛(D类). 数据表示为三个重复实验的平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01.E类和F类：在缺乏（−）或存在（+）PI3激酶抑制剂LY294002（10μmol/L）的情况下，HB-EGF治疗后p-S6R的典型Western blot和密度定量。数据表示为三个重复实验的平均值±SEM*P（P）< 0.05.
图5
图5
GLU+IL输注诱导6月龄大鼠β细胞增殖与mTOR激活相关。A类：对6个月龄输注大鼠的胰腺切片进行胰岛素染色（INS；红色），并用Ki67染色（绿色）评估增殖情况。B类：以磷酸化S6R（p-S6R；白色）染色作为mTOR活化的指标。图片代表每组三只动物。
图6
图6
抑制EGFR和mTOR可防止6个月大鼠对GLU+IL输注的β细胞增生和肥大。A类：输注GLU+IL并用载体、AG1478或雷帕霉素（0.5 mg/kg/d）治疗的6月龄大鼠的β细胞质量的形态计量学定量。B类：β-细胞大小是通过将胰岛素阳性区域的表面除以该区域中胰岛素阳性细胞的数量来确定的。数据是每组4-5只动物的平均值±SEM*P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.001.
图7
图7
抑制EGFR或mTOR可阻断6个月大鼠对GLU+IL输注的β细胞增殖和FOXM1信号传导。给6个月大鼠输注GLU+IL，并用载体AG1478（AG）或雷帕霉素（0.5 mg/kg/天）治疗。A类：胰腺切片进行胰岛素染色（Ins；红色），Ki67染色（绿色）通过手动计数至少2000个胰岛素阳性（Ins+)每只动物的细胞数。B类：增殖被确定为双阳性Ki67的百分比+/Ins公司+单元格超过总Ins+细胞。数据为每组五只动物的平均值±SEM***P（P）< 0.001.C类：胰腺切片染色以检测胰岛素（红色）和FOXM1（绿色）。白色箭头和插图表示FOXM1的表达和核定位。D类：胰腺切片染色以检测胰岛素（红色）和AURKB（绿色）。中的图像A类,C类、和D类代表每组五只动物。E类：定量RT-PCR测量FOXO3a、FOXM1和AURKB的mRNA水平。mRNA水平归一化为亲环素A，并相对于载体处理的SAL融合组进行表达。数据是每组4-5只动物的平均值±SEM**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.F类：营养素诱导β细胞增殖的建议模型。6月龄大鼠注射GLU+IL可诱导胰岛素抵抗，从而导致胰岛中前-HB-EGF的表达增加。经细胞外基质蛋白酶裂解后，HB-EGF激活EGFR。在EGFR下游，mTOR的激活导致FOXM1诱导的β细胞增殖。雷帕霉素。
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