Myofibroblastic cells function as progenitors to regenerate murine livers after partial hepatectomy

doi:10.1136/gutjnl-2013-305962

.2014年8月；63(8):1333-44.

doi:10.1136/gutjnl-2013-305962。 Epub 2013年10月30日。

肝部分切除后肌纤维母细胞作为祖细胞再生小鼠肝脏

附属公司

¹美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学中心医学部消化科。
²美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学中心内科消化科，英国伦敦肝脏研究基金会肝病研究所再生与修复部。
^三美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学中心医学部消化科美国北卡罗莱纳州达伦姆杜克退伍军人事务医学中心消化科。

PMID： 24173292
预防性维修识别码：项目经理4006344
内政部： 10.1136/gutjnl-2013-305962

肝部分切除后肌纤维母细胞作为祖细胞再生小鼠肝脏

M Swiderska-Syn公司等。肠子. 2014年8月.

.2014年8月；63(8):1333-44.

doi:10.1136/gutjnl-2013-305962。 Epub 2013年10月30日。

作者

M Swiderska-Syn公司¹, W K合成², 谢G¹, L Krüger先生¹, M V马查多¹, G卡拉卡¹, G A米歇洛蒂¹, S S Choi先生^三, R T普雷蒙特¹, A M迪尔¹

附属公司

¹美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学中心医学系消化科。
²美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学中心内科消化科，英国伦敦肝脏研究基金会肝病研究所再生与修复部。
^三美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学中心医学部消化科美国北卡罗莱纳州达伦姆杜克退伍军人事务医学中心消化科。

PMID： 24173292
预防性维修识别码：项目经理4006344
内政部： 10.1136/gutjnl-2013-305962

摘要

目标：Smoothened（SMO）是Hedgehog（Hh）通路的辅受体，促进慢性肝损伤的纤维化修复。我们通过部分肝切除术（PH）后α平滑肌肌动蛋白（αSMA）+细胞中SMO的条件性缺失来研究SMO+肌成纤维细胞（MF）在肝再生中的作用。

设计：用载体（VEH）或三苯氧胺（TMX）处理αSMA-Cre-ER（T2）×SMO/flox小鼠，并在PH后24-96 h处死。通过qRT-PCR和定量免疫组织化学（IHC）分析再生肝脏的增殖、祖细胞和纤维化。结果正常化为PH时切除的肝段。对于谱系追踪研究，用VEH或TMX处理αSMA-Cre-ER（T2）×ROSA-Stop-flox-yellow荧光蛋白（YFP）小鼠；对肝脏进行YFP染色，并用流式细胞仪（FACS）分析PH后48和72小时分离的肝细胞的YFP。

结果：PH后，VEH-αSMA-SMO小鼠增加了Hh基因的表达，短暂积累MF、纤维化和肝祖细胞，最终表现为肝细胞和胆管细胞的增殖。相比之下，TMX-αSMA-SMO小鼠表现出全肝SMO表达缺失、Hh基因抑制、静止HSC的积累增加但MF、纤维化和祖细胞的积累减少、肝细胞和胆管细胞增殖受到抑制以及肝重量恢复减少。在TMX-αSMA-YFP小鼠中，PH后48-72小时，许多祖细胞、胆管细胞和高达25%的肝细胞为YFP+，表明肝上皮细胞来源于αSMA-YFP+细胞。

结论：Hh信号促进静止的肝星状细胞向纤维生成性MF的转变，其中一些成为PH后再生肝上皮细胞室的祖细胞。因此，瘢痕形成是成功肝再生的一个组成部分。

关键词：基础科学；肝脏再生；分子机制。

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利益冲突声明

利益冲突：

所有作者均声明与本研究无利益冲突

数字

**图1。阻断Hh信号减弱PH后的纤维生成结果**
αSMA-核心-ER^T2段×SMO/flox双转基因（DTG）小鼠（n=55）用载体（VEH）或TMX处理，然后在PH后24小时（VEH:n=7；TMX:n=8）、48小时（VEH：n=7，TMX:n=7）、72小时（VEH-n=6；TMX=n=6）和96小时（VEH2:n=6，TMX=n=6）处死。**（A）**代表性肝脏切片用天狼星红（SR）/固绿染色，以显示胶原纤维；原始放大倍数x20。**（B）**形态计量学SR定量；通过Metaview软件随机选择50个字段进行分析**（C）**分离肝脏总RNA，用qRT-PCR分析胶原蛋白1α1 mRNA。**（D）**VEH和TMX治疗组肝羟脯氨酸的定量；数据表示为每克肝组织中羟脯氨酸的毫克数。**（E）**对代表性肝脏切片进行肝纤维化标记物、αSMA、Desmin和Vimentin染色；原始放大倍数x20。通过形态计量学（50个随机场/组；原始放大倍数x20）分别对来自载体和TMX治疗的DTG小鼠的αSMA+、Desmin+和Vimentin+细胞进行量化。**（F）**总肝脏αSMA、Desmin和Vimentin mRNA表达。对于形态计量学和mRNA数据，结果表示为相对于静止肝组织的折叠变化；绘制了平均值±SEM。数据采用单因素方差分析。^#与静止肝相比p<0.05*与时间匹配的Veh治疗组相比，p<0.05。

**图2。PH后αSMA+细胞Hh信号缺失导致肝再生受损**
如图1所示，对DTG小鼠进行治疗。（A） VEH或TMX治疗的DTG小鼠PH后的肝重量（LW）/体重（BW）比值。结果表示为相对于静止肝组织的折叠变化*与时间匹配的VEH治疗小鼠相比，p<0.05。**（B）**VEH和TMX处理的DTG小鼠的代表性核Ki67染色。为了量化Ki67+染色，对20个随机选择的20个区域进行评估。结果表示为相对于静止肝组织的折叠变化；^#与静止肝相比p<0.05*与时间匹配的VEH治疗组相比，p<0.05。**（C）**VEH和TMX处理的DTG小鼠肝脏切片的代表性H&E染色。**（D）**两组小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平；结果以平均值±SEM的形式绘制。**（E）**每个高倍视野（HPF）的梗死数。为了量化梗死，随机选择50个区域，对20个区域进行评估；结果用平均值±SEM表示。**（F）**qRT-PCR分析IL6和HGF（两种营养因子）在全肝mRNA中的表达。结果表示为相对于静止肝组织的倍数变化；^#与静止肝相比p<0.05*与时间匹配的VEH治疗组相比，p<0.05。

**图3。αSMA+细胞是上皮（肝细胞和导管细胞）的祖细胞**
αSMA-核心-ER^T2段×ROSA-Stop-flox-YFP（DTG/YFP）小鼠（n=24）用载体或TMX治疗，然后在PH后24小时、48小时和72小时处死。**（A）**显示了肝脏YFP的代表性免疫染色；原始放大倍数x20。**（B）**每个HPF的YFP+细胞的区域定量；随机选择20个领域进行评估。**（C）**每个HPF中YFP+肝细胞在YFP+细胞中的比例；随机选择40个领域进行评估。结果表示为平均值±SEM*与VEH治疗组（V）相比，p<0.05。**（D）**显示了TMX处理的DTG/YFP小鼠肝脏Lgr5（棕色）和YFP（绿色）的双重免疫染色和肝脏Lgr（棕色）（底部）的单一免疫染色。肝细胞、导管（黑色箭头）和基质区域（白色箭头）的代表性图像。**（E）**在PH后48和72小时分离原代肝细胞，并通过流式细胞术分析细胞内YFP荧光。显示了YFP阳性细胞的百分比。**（F）**在PH后48和72小时分离WT小鼠的原代肝细胞，并用qRT-PCR分析Lgr5 mRNA。结果表示为相对于静止肝细胞的折叠变化；绘制了平均值±SEM*与静止肝细胞相比p<0.05。

**图4。阻断αSMA+细胞的Hh信号抑制PH后肝祖细胞的积累**
αSMA-核心-ER^T2段×SMO/flox DTG小鼠按图1所示进行治疗。代表性免疫组织化学（原始放大倍数x20），形态计量数据**（A）**和全肝mRNA表达**（B）**用于Lgr5、Sox9、αFP和K19。分别来自载体和TMX处理的DTG小鼠的Lgr5+、Sox9+、αFP+和K19+细胞通过形态计量学或每个HPF的阳性细胞数进行定量（Lgr5和αFP:50随机HPF；Sox9和K19:20随机HPF）。结果表示为相对于静止肝组织的折叠变化；平均值±SEM；^#与静止肝相比p<0.05*与时间匹配的VEH治疗组相比，p<0.05。**（C）**VEH处理的DTG小鼠PH后72小时Lgr5免疫反应带型；肝细胞和导管细胞中显示Lgr5+的黑色箭头；白色箭头显示类似HSC/MF的Lgr5+正弦细胞。**（D）**使用DTG/YFP小鼠进行的血统追踪研究（如图3所示）显示PH后72小时肝细胞、导管细胞（黑色箭头）和正弦细胞（白色箭头）中相应的YFP染色。

**图5。αSMA+细胞SMO的条件性破坏破坏了PH后肝再生所必需的上皮-间充质转换和间质-上皮转换**
如图1所示，对DTG小鼠进行治疗。代表性免疫组织化学、形态计量学数据**（A）**和全肝mRNA表达**（B）**E-Cacherin、PPARγ和GFAP；原始放大倍数x20。通过形态计量学（50个随机区域）分别对来自载体和TMX治疗的DTG小鼠的E-Caddherin+、PPARγ+和GFAP+细胞进行定量。结果表示为相对于静止肝组织的折叠变化；平均值±SEM；^#与静止肝相比p<0.05*与时间匹配的VEH治疗组相比，p<0.05。**（C）**PH后0和48小时E-cadherin免疫染色的带状模式；显示高倍（100倍）下相应显微照片的底部面板。**（D）**在培养第4天，从SMO/flox单转基因小鼠分离的原代HSC感染表达GFP的腺病毒（Ad-GFP，对照）或Cre-reumbise（Ad-Cre，用于Hh信号中间产物的条件缺失，SMO）。在培养第7天收集细胞；通过qRT-PCR分析lgr5、结蛋白和αSMA mRNA。结果表示为相对于第0天（静止）HSC中各自基因表达的折叠变化；平均值±SEM*与HSC第0天相比，p<0.05。

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