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.2013年11月；8(11):2281-2308.
doi:10.1038/nprot.2013.143。 Epub 2013年10月24日。

利用CRISPR-Cas9系统进行基因组工程

F安然 # 1 2 三 4 5, 帕特里克·D·苏 # 1 2 三 4 5, 杰森·赖特 1, 维尼塔·阿加瓦拉 1 6 7, 大卫·A·斯科特 1 2 三 4, 张峰（音） 1 2 三 4
附属公司

利用CRISPR-Cas9系统进行基因组工程

F安然等。 Nat协议. 2013年11月.

摘要

靶向核酸酶是高精度介导基因组改变的有力工具。来自微生物簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）适应性免疫系统的RNA-guided Cas9核酸酶可以通过简单地在其引导RNA中指定20-nt靶向序列来促进真核细胞的高效基因组工程。在这里，我们描述了一套通过哺乳动物细胞中的非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）进行Cas9介导的基因组编辑的工具，以及用于下游功能研究的改良细胞系的生成。为了最大限度地减少靶外切割，我们进一步描述了一种使用带有成对导向RNA的Cas9缺口酶突变体的双缺口策略。该方案为靶点的选择、切割效率的评估和离靶活性的分析提供了实验推导的指南。从目标设计开始，基因修改可以在1-2周内完成，修改后的克隆细胞株可以在2-3周内获得。

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图1
图1
RNA引导的Cas9核酸酶示意图。来自化脓链球菌（黄色）靶向基因组DNA（例如显示人类EMX1型基因座）由由20-nt引导序列（蓝色）和支架（红色）组成的sgRNA。引导序列与DNA目标（顶部链上的蓝色条）配对，直接位于必需的5′-NGG相邻基序（PAM；粉红色）的上游。Cas9介导PAM上游约3 bp的DSB（红色三角形）。
图2
图2
DSB修复促进基因编辑。由Cas9（黄色）诱导的DSB可以通过两种方式之一进行修复。在容易出错的NHEJ途径中，DSB的末端被内源性DNA修复机制处理并重新连接，这可能导致连接位点的随机indel突变。基因编码区内发生的Indel突变会导致移码和过早终止密码子的产生，从而导致基因敲除。或者，可以提供质粒或ssODN形式的修复模板来利用HDR通路，从而实现高保真和精确的编辑。DNA上的单牌缺口也能诱发HDR。
图3
图3
实验时间表和概述。描述了试剂设计、构建、验证和细胞系扩展的步骤。为每个靶点设计定制的sgRNA（浅蓝色条）以及基因分型引物生物信息学通过CRISPR设计工具(http://tools.genome-engineering.org). sgRNA引导序列可以克隆到同时含有sgRNA支架骨架（BB）和Cas9，pSpCas9（BB）的表达质粒中。由此产生的质粒被注释为pSpCas9（sgRNA）。然后将完整且经序列验证的pSpCas9（sgRNA）质粒和用于促进HDR的可选修复模板转染到细胞中，并对其介导靶向切割的能力进行分析。最后，转染细胞可以克隆扩增，获得具有特定突变的等基因细胞系。
图4
图4
靶点选择和试剂制备。(一)对于化脓链球菌Cas9，20-bp靶点（以蓝色突出显示）必须在其3′端接上5′-NGG，它可以出现在基因组DNA的顶链或底链中，如人类的例子EMX1型基因。我们建议使用CRISPR设计工具(http://tools.genome-engineering.org)以便于目标选择。(b条)Cas9表达质粒（pSpCas9）和PCR-扩增U6-driven sgRNA表达盒的联合转染示意图。通过使用包含U6启动子的PCR模板和固定正向引物（U6-Fwd），sgRNA-encoding DNA可以附加到U6反向引物（U6-Rev）上，并合成为扩展DNA寡核苷酸（IDT的超分子寡核苷酸）。注意，U6-Rev引物中的引导序列是针对来自顶部链（蓝色）的示例靶序列设计的，是5′-NGG-PAM之前20 bp靶序列的反向补足。在反向引物中直接将额外的胞嘧啶（灰色矩形中的“C”）3′附加到目标序列，以使鸟嘌呤成为U6转录物的第一个碱基。(c（c）)引导序列寡核苷酸无疤痕克隆到含有Cas9和sgRNA支架（pSpCas9（BB））的质粒的示意图。顶链示例（蓝色）的引导寡核苷酸包含用于连接到pSpCas9（BB）中的一对BbsI位点的悬垂，顶链和底链方向与基因组靶点的方向匹配（即，顶寡核苷酸是基因组DNA中5′-NGG之前的20 bp序列）。用BbsI消化pSpCas9（BB）允许用退火的寡聚体的直接插入代替II型限制性位点（蓝色轮廓）。同样，在U6转录的引导序列的5′端添加一个G-C碱基对（灰色矩形），这不会对靶向效率产生不利影响。pSpCas9（BB）的替代版本还包含GFP或嘌呤霉素抗性基因等标记，以帮助选择转染细胞。
图5
图5
针对多重sgRNA的NHEJ的预期结果。(一)用于测定吲哚百分比的SURVEYOR分析示意图。首先，通过PCR扩增来自Cas9-靶向细胞异质群体的基因组DNA。然后将放大器缓慢再退火以产生异质双工。退火后的异质双体被SURVEYOR核酸酶裂解，而同源双体则保持完整。Cas9-介导的切割效率（indel百分比）是根据切割DNA的分数计算的，由凝胶带的综合强度决定。(b条)两个sgRNAs（橙色和深蓝色条）被设计用于瞄准人类格栅2B和DYRK1A公司基因座。SURVEYOR凝胶显示转染细胞中两个基因座的修饰。彩色箭头表示每个轨迹的预期碎片大小。(c（c）)成对sgRNAs（浅蓝色和绿色条带）被设计用于切除人类的外显子（深蓝色）EMX1型轨迹。靶序列和PAM（粉红色）以各自的颜色显示，Cas9的裂解位点以红色三角形表示。预测的连接如下所示。通过PCR（使用Out-Fwd和Out-Rev引物）对从转染sgRNA 3、4或两者的细胞群体中分离的单个克隆进行分析，显示约270 bp长的缺失。显示了无修饰（12/23）、单等位基因修饰（10/23）和双等位基因（1/23）修饰的代表性克隆。(d日)克隆系的量化EMX1型外显子缺失。两对sgRNA（3.1和3.2，左翼sgRNAs；4.1和4.2，右翼sgRNA）用于介导一个左右大小不同的缺失EMX1型外显子。对转染细胞进行克隆分离和扩增，以进行缺失和反转事件的基因分型分析。在筛选的105个克隆中，51个（49%）和12个（11%）分别携带杂合和纯合缺失。由于删除连接可能是可变的，因此只给出了近似的删除大小。
图6
图6
HEK和HUES9细胞中HDR的预期结果。(一)可以使用靶向质粒或具有同源臂的ssODN（正义或反义）编辑Cas9（红三角）切割的靶基因组位点的序列。为了检测HDR的效率，我们将HindIII位点（红条）引入目标位点，该位点是用退火到同源区之外的引物进行PCR扩增的。用HindIII消化PCR产物可发现HDR事件的发生。(b条)ssODN相对于感兴趣的位点在正、反义（s或a）方向定向，可以与Cas9结合使用，以在目标位点实现高效的HDR介导的编辑。建议在修饰的每一侧（红色条）都有40 bp的最小同源区域，最好是90 bp。(c（c）)ssODN对HDR的影响示例EMX1型使用野生型Cas9和Cas9内切酶（D10A）显示该基因座。每个ssODN都包含90 bp的同源臂，两侧插入12 bp的两个限制性位点。
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