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.2013年11月5日；18(5):726-39.
doi:10.1016/j.cmet.2013.09.013。 Epub 2013年10月17日。

mTOR复合物2通过FoxO乙酰化和c-Myc上调控制胶质母细胞瘤糖酵解代谢

肯塔·马苏 1, 田中和弘, 大卫·阿卡万, 伊万·巴比奇, 比阿特丽斯·基尼, 松谷富武, 岩波明夫, 刘峰（音）, Genaro R别墅, 顾玉超, 卡尔·坎波斯, 朱少军, 杨慧君, 威廉·H·勇, 蒂莫西·F·克劳西, 英戈·K·梅林霍夫, 韦伯斯特·K·卡文尼, 鲁本·J·肖, 保罗·米舍尔
附属公司

mTOR复合物2通过FoxO乙酰化和c-Myc上调控制胶质母细胞瘤糖酵解代谢

肯塔·马苏等。 单元格元. .

摘要

有氧糖酵解（Warburg效应）是癌症的核心特征，但其分子机制尚不清楚。在这里，我们确定了mTORC2在癌症代谢重编程中意外的中心作用，它通过最终调节c-Myc的细胞水平来控制糖酵解代谢。我们发现，mTORC2促进IIa类组蛋白脱乙酰化酶的失活磷酸化，从而导致FoxO1和FoxO3的乙酰化，进而从抑制性miR-34c依赖网络中释放c-Myc，和c-Myc水平在临床样本中高度相关，GBM患者的生存期较短。这些结果确定了mTORC2在调节癌症糖酵解代谢中的特异性、Akt非依赖性作用。

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利益冲突声明

所有作者均未报告利益冲突。

数字

图1
图1。通过c-Myc在葡萄糖中生长GBM需要mTORC2
（A） 在含有葡萄糖或半乳糖的培养基中培养的Scramb或Rictor击倒（KD）U87-EGFRvIII细胞的生长曲线。误差条，±SD。免疫印迹显示U87-EGFRvIII细胞中Rictor KD的验证。（B） 用葡萄糖剥夺（Gluc-）或糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG，10 mM）处理48小时后，GFP或Rictor过度表达U87细胞的细胞死亡。免疫印迹显示证实Rictor在U87细胞中过度表达。（C） 对照组或Rictor KD U87-EGFRvIII细胞中糖酵解和磷酸戊糖途径（PPP）酶的mRNA水平。（D） 以细胞为基础的免疫组化分析糖酵解酶和增殖标记物Ki-67在含有scramb或Rictor shRNA的U87-EGFRvIII异种移植瘤中的表达（n=3）。比例尺，50µm。NC表示每个样品的阴性对照获得的平均染色强度。（E-G）对照组与Rictor KD U87-EGFRvIII细胞（E）结合c-Myc KD（F）或HIF-1αKD（G）的相对葡萄糖消耗量和乳酸生成量。（H） 对U87细胞中Rictor过度表达和U87-EGFRvIII细胞中Rictor-KD的c-Myc表达进行生化分析。（一） 用有关Akt、mTORC1（猛禽）和mTORC2（Rictor）的siRNA对U87-EGFRvIII细胞中的c-Myc进行免疫印迹分析。除生长曲线（A）、SEM外的所有误差条。另请参见图S1。
图2
图2。mTORC2通过FoxO乙酰化调节c-Myc和糖酵解
（A） 经Akt抑制剂（Akti-1/2）或Pan-PI3K抑制剂（LY294002）处理24h的U87-EGFRvIII中磷酸化FoxO、乙酰化Fox0和c-Myc蛋白水平。（B） 在与GFP-FoxO1和Flag-FoxO3共转染的U87-EGFRvIII细胞中，乙酰赖氨酸（Ac-K）与FoxO质粒的关联性的IP分析，并使用或不使用Rictor耗尽。（C） 使用具有Rictor过度表达或Rictor KD的U87核提取物进行EMSA分析，显示DNA/FoxO蛋白EMSA复合物。TATA-结合蛋白（TBP）的免疫印迹用于归一化核提取物的蛋白质负荷。定量条形图显示了各组的相对DNA/FoxO复合物水平。（D） GFP-FoxO1突变体示意图：3A，Akt介导的磷酸化抗性；5KR，抗乙酰化；5KQ，组成乙酰化形式。免疫荧光图像表示表达GFP-FoxO1和突变体的U87-EGFRvIII细胞。比例尺，20µm。（E） 野生型3A-或5KR-FoxO1对c-Myc和裂解PARP影响的免疫印迹分析。（F） 空载体或过表达U87-EGFRvIII细胞的FoxO1-5KR突变株中的相对葡萄糖消耗量、乳酸生成量、谷氨酰胺摄取量和谷氨酸分泌量，无论c-Myc是否耗竭。（G） 用Rictor表达载体和野生型/突变型FoxO表达载体联合转染的U87细胞中c-Myc的免疫印迹评估。误差条，SEM。另请参见图S2。
图3
图3。mTORC2通过IIa类HDAC控制FoxO乙酰化，与Akt无关
（A） 对U87-EGFRvIII细胞中的c-Myc、磷酸化HDAC和几种形式的FoxO进行免疫印迹分析，显示与Akt和mTOR复合物有关的siRNA。（B） 免疫印迹显示过度表达GFP或Rictor DNA质粒的U87细胞磷酸化IIa类HDAC的变化。（C） 几种神经胶质瘤细胞系中p-EGFR、p-NDRG1和IIa类HDAC状态的免疫印迹分析。（D） EGFR突变的非小细胞肺癌（NSCLC）细胞（H1650）中磷酸化HDAC、乙酰化FoxO和c-Myc的免疫印迹分析，显示Akt和mTOR复合物的KD。（E） 免疫印迹显示U87细胞中乙酰化FoxO和c-Myc的变化，并显示针对IIa类HDAC的siRNA。（F） siRNA介导的HDAC4/5缺失后FoxO靶基因U87细胞的qRT-PCR。（G） 免疫印迹显示携带siRNAs的U87细胞的c-Myc数量对抗IIa类HDAC，并伴有FoxO DNA质粒的过度表达。（H） 加或不加c-Myc缺失的Scramb或IIa类HDAC KD U87细胞的细胞增殖试验。siHDAC细胞与干扰siRNA细胞或siHDAC/siMyc细胞之间的比较p<0.01。误差线，±SD。除生长曲线（H）、SEM外的所有误差线。见图S3。
图4
图4。乙酰化FoxO通过miR-34c调节c-Myc
（A） 打乱与FoxO KD U87细胞中miR-145和miR-34c的相对表达。（B） 含有miRNA模拟物的U87-EGFRvIII细胞和含有miRNA抑制剂的U87细胞中的Myc蛋白水平。（C） 转染指定FoxO质粒的U87-EGFRvIII细胞中miR-145和miR-34c的相对表达变化。（D） 对转染对照载体或GFP-FoxO1-5KR的U87-EGFRvIII细胞进行ChIP分析，并评估miR-34c启动子（Kress等人，2011）和miR-145启动子（Gan等人，2010）区域中GFP-Fox O1结合元件（BEs）的恢复情况。（E） 在U87-EGFRvIII细胞中，通过抑制miR-34c而非miR-145，5KR-FoxO1介导的c-Myc下调被逆转。（F） 空载体或Rictor-expressing载体转染的U87细胞中miR-145和miR-34c mRNA的变化。（G） 免疫印迹评估联合转染shRictor和miRNA抑制剂的U87-EGFRvIII细胞中c-Myc的变化。误差线，SEM。
图5
图5。对PI3K和Akt抑制剂的耐药性由FoxO的mTORC2依赖性乙酰化和c-Myc的维持介导
（A） 通过p-NDRG1蛋白的Western blotting和Rictor mRNA的qRT-PCR显示U87-EGFRvIII细胞在Akt/PI3K抑制下的mTORC2激活。（B）PI3K/Akt抑制剂联合或不联合Rictor KD治疗24小时的U87-EGFRvIII细胞中FoxO靶基因的qRT-PCR分析。同时瞄准PI3K/Akt和mTORC2可显著恢复FoxO活动。（C） 用PI3K/Akt抑制剂处理C-Myc基因的U87-EGFRvIII细胞，转染或不转染FoxO1-5KR后进行qRT-PCR。（D） 用PI3K/Akt抑制剂联合或不联合Rictor KD处理的U87 EGFRvIII细胞中c-Myc的免疫印迹评估。（E） PI3K/Akt抑制剂联合或不联合Rictor KD处理的U87-EGFRvIII细胞中Myc相关代谢酶mRNA水平。误差线，SEM。另请参见图S4。
图6
图6。联合抑制PI3K/Akt和mTORC2抑制乙酰化FoxO-Myc信号转导并促进肿瘤细胞死亡
（A） PI3K/Akt抑制剂处理U87-EGFRvIII细胞24小时后，结合或不结合Rictor KD进行TUNEL染色。绿色，TUNEL染色；蓝色，DAPI染色。（B） 经PI3K/Akt抑制剂处理的定量TUNEL阳性U87-EGFRvIII细胞，条形图中结合或不结合Rictor KD。（C） 将EGFR-amplified patient derived TS516 GBM肿瘤球植入免疫缺陷小鼠体内，随后用双重PI3K/mTOR抑制剂XL765治疗。代表性免疫印迹显示FoxO乙酰化、c-Myc和糖酵解酶表达以及凋亡肿瘤细胞死亡（裂解PARP）的状态。miR-34c的相对表达如方框图所示。使用载体治疗组（n=5）和XL765治疗组（n=5）的长度和宽度测量肿瘤体积。误差线，SEM。
图7
图7。活检样本中mTORC2信号、乙酰化FoxO和c-Myc表达高度相关，并与GBM患者预后不良相关
（A） GBM组织微阵列（TMA）的Ac-FoxO和c-Myc免疫染色，包括80个GBM样本和26个正常脑组织。高倍镜下TMA载玻片和阴性和阳性核心的视图，显示Ac-FoxO的细胞质染色和c-Myc的细胞质/核染色。Ac-FoxO和c-Myc分别在45.0%和58.8%的肿瘤中上调。（B） 基于Ac-FoxO与c-Myc相关性的TMA免疫组织化学分析。（C） 条形图显示基于TMA的Ac-FoxO阳性或阴性肿瘤与p-NDRG1 IHC阳性的差异关联。（D） 基于TMA的c-Myc+/-肿瘤与p-NDRG1免疫阳性的差异关联。P值通过χ确定2用于独立性测试（B-D）。（E） 通过c-Myc表达分类的36例原发性和继发性GBM样本的Kaplan-Meier生存分析。使用Log-rank（Mantel-Cox）检验确定Kaplan-Meier生存曲线分析的p值。（F） mTORC2通过乙酰化抑制FoxO活性，这可能绕过PI3K/Akt抑制，导致c-Myc上调，c-Myc是GBM细胞增殖和肿瘤代谢的关键下游效应器。另见图S5。
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中的注释

  • mTORC2决定了Warburg效应和耐药性。
    Masui K、Cavenee WK、Mischel PS。 Masui K等人。 细胞周期。2014;13(7):1053-4. doi:10.4161/cc.28377。Epub 2014年2月28日。 细胞周期。2014 PMID：24583874 免费PMC文章。 没有可用的摘要。

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