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.2013;9（10）：e1003701。
doi:10.1371/journal.ppat.1003701。 Epub 2013年10月10日。

CD81在流感病毒脱衣和出芽中的双重作用

江河 1, 孙爱玲, 米里亚姆五世·布尼, 杜里·金, 迈克尔·戴维森, 庄晓伟
附属公司

CD81在流感病毒脱衣和出芽中的双重作用

江河等。 公共科学图书馆病理学. 2013.

摘要

作为一种强制性病原体，流感病毒协同宿主细胞机制来窝藏感染并产生子代病毒。为了表征病毒与宿主细胞的相互作用，最近进行了几个全基因组siRNA筛选和蛋白质组分析，以确定与流感病毒感染有关的宿主因子。CD81已成为两个siRNA筛选和一个蛋白质组学研究的最佳候选之一。然而，迄今为止，CD81在流感感染中的确切作用尚未阐明。在这项工作中，我们检查了CD81缺失对流感感染主要步骤的影响。我们发现CD81主要在两个阶段影响病毒感染：病毒进入时脱膜和病毒出芽。CD81标记了一个特定的内体群体，约一半的融合流感病毒颗粒在CD81阳性内体中融合。CD81的耗尽导致病毒融合和感染的实质性缺陷。在病毒组装过程中，CD81被招募到质膜上的病毒出芽部位，特别是特定的亚病毒部位。对于球形和稍长的流感病毒，CD81定位于子代病毒的生长尖端和出芽颈部。CD81基因敲除导致出芽缺陷，并导致出芽病毒长而易于粘附在质膜上。即使脱膜缺陷得到补偿，CD81敲除细胞中的子代病毒生成也显著减少。在丝状病毒中，CD81沿着病毒丝分布在多个位点。综上所述，这些结果表明CD81在流感感染周期的进入和萌芽阶段都发挥着重要作用。

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数字

图1
图1。CD81参与流感病毒感染的早期和晚期。
A） 用非靶向对照siRNA或CD81 siRNA1处理A549细胞48小时，并用抗CD81抗体进行免疫染色。图像是共焦z堆叠的最大投影。B） 用对照或CD81 siRNA处理A549细胞48小时。收集细胞，用所示抗体进行免疫印迹。Tubulin被用作负荷控制。C） CD81缺失会削弱流感病毒感染。用siRNAs或mock处理A549细胞48小时，然后以小于0.1的MOI感染X-31、WSN或Udorn 36小时。通过菌斑试验测定上清液中的病毒滴度。阴影条表示用不含siRNA的转染溶液处理的模拟细胞中测量的传染性；空心条显示了用对照非靶向siRNA处理的细胞的传染性；黑色实心条表示用CD81 siRNA处理过的细胞的传染性。D）表达病毒NP的受感染细胞的数量在CD81被击倒后减少了约50%。将经siRNA处理的A549细胞感染WSN、X-31或Udorn病毒，MOI小于0.1，持续8小时，不进行酸旁路，并通过流式细胞术测定表达NP的细胞比例。E） 当通过酸旁路治疗诱导流感感染以消除进入缺陷时，病毒NP的表达不受CD81敲低的影响。允许siRNA处理的A549细胞在冰上与WSN或X-31病毒结合1小时，用温热的低pH PBS缓冲液（pH 4.5）处理2分钟。8小时后，收集细胞并对其进行NP染色，以进行流式细胞术分析。F） 在感染流感病毒的CD81敲除细胞中，通过酸-旁路处理，上清液中的病毒滴度降低了～50%或更多。简单地说，病毒可以在冰上与对照细胞或CD81敲除细胞结合1小时。清洗未结合的病毒颗粒，加入低pH缓冲液2分钟，以触发病毒在质膜上的融合。感染后17小时，收集上清液，并通过菌斑试验测定病毒滴度。对于图1C–1F，误差线是三个独立实验得出的标准偏差。一个双尾学生t检验对所有数值数据执行，并显示数据的p值。p值小于0.05表示存在统计显著差异。
图2
图2。CD81不需要用于病毒结合、内化或传递到早期内体。
A） 流式细胞术检测到CD81-敲除不影响病毒结合。紫红色、蓝色和橙色曲线分别对应于未添加病毒的细胞、流感病毒结合后的对照细胞和流感病毒结合之后的CD81-击倒细胞的强度曲线。B） CD81敲除不影响病毒颗粒内吞的数量。内化病毒颗粒的数量以点图形式显示，中线代表平均值，顶/底线代表标准偏差。对每种情况下随机选择的至少40个细胞进行分析。C） 与早期内体共定位的病毒颗粒百分比不受CD81敲除的影响。早期内体用抗EEA1抗体进行免疫染色。数据绘制与（B）类似。对每种情况下随机选择的至少40个细胞进行分析。D） CD81缺失不会影响RSV或假型MLV感染。将siRNA处理的A549细胞感染不同剂量的RSV和伪型MLV病毒24小时。对于RSV病毒感染，用流式细胞术定量RSV融合蛋白的表达，而对于伪型MLV病毒，分析GFP信号。一个双尾学生t检验对所有数值数据执行，并显示数据的p值。
图3
图3。大部分病毒被输送到CD81阳性内体并在其中融合。
A） CD81基本上与Rab5共定位。用CD81-mEmerald和RFP-Rab5电穿孔A549细胞。24小时后，将细胞固定并成像。方框区域的放大图像显示在右侧。比例尺：10µm。B） 流感病毒颗粒进入CD81+内体。A549细胞与Alexa Fluor 647标记的X-31病毒（红色）在冰上冷结合30分钟，然后在37°C下追逐15分钟。将样品固定并对CD81（绿色）进行免疫染色。方框区域的放大图像显示在右侧。所有图像均为共焦XY横截面。比例尺：10µm。C） 流感病毒颗粒进入CD81阳性内体后融合。添加了DiD-标记X-31的活细胞共焦成像就地将CD81-mEmearld表达的A549细胞维持在37°C。以0.5秒的间隔收集图像。C-1）在不同时间点拍摄的多张快照，白色圆圈表示病毒。C-2）所示DiD标记病毒的荧光信号随时间的变化。注意，在515秒时DiD信号突然增加，这表明病毒融合事件。D） 流感病毒也可以在CD81阴性内体中融合。D-1）在不同时间点拍摄的多张快照，白色圆圈表示病毒。D-2）所示DiD标记病毒的荧光信号随时间的变化。病毒颗粒在422秒融合。E）在从结合到融合的61个病毒颗粒中，52±8%进入CD81+内体并融合，而其余48±8%在CD81-内体融合。四个独立实验的结果表明，±误差表示这些实验得出的标准偏差。F） CD81缺失后，病毒融合受损。DiD-标记的X-31被允许在冰上与A549细胞结合30分钟，然后在37°C下追逐指定的时间。细胞立即胰酶化固定，流式细胞仪分析。绘制了DiD强度相对于初始DiD强度的增加。误差线是由重复实验得出的标准偏差。
图4
图4。CD81缺失不会影响病毒蛋白的表达和转运。
A） CD81敲低不影响用酸旁路处理感染流感病毒的细胞中病毒NP蛋白的表达。除了在感染后的不同时间点和不同剂量的病毒下评估表达水平外，实验的执行与1E）中的相似。绘制了NP+细胞中NP表达细胞的百分比和NP表达水平。B） CD81敲除不影响经酸-旁路治疗的流感病毒感染细胞中病毒M1蛋白的表达。除了对细胞进行M1免疫染色外，实验的执行与（A）中的相似。绘制M1+细胞的百分比和M1+细胞中M1的表达水平。C） CD81敲除不影响经酸-旁路治疗的流感病毒感染细胞中病毒M2蛋白的表达。除了对细胞进行M2免疫染色外，实验的执行与（A）中的相似。绘制M2+细胞的百分比和M2+细胞中的M2表达水平。D） CD81敲除不会影响通过酸-旁路治疗感染流感病毒的细胞中被输送到细胞表面的M2蛋白的数量。实验与（C）中的相似，只是细胞被染色为M2而没有渗透。绘制了M2+细胞的百分比和M2+细胞中的表面M2表达水平。E） 在用酸旁路处理感染流感病毒的细胞中，CD81敲低不影响输送到细胞表面的NA蛋白的量。通过共焦图像评估X-31病毒感染的对照细胞或CD81 siRNA处理细胞的NA表达水平。一个双尾学生t检验对所有数值数据执行，并显示数据的p值。
图5
图5。CD81被招募到病毒萌芽站点。
A） CD81被招募到X-31感染细胞的病毒萌芽区。用X-31感染A549细胞16小时。细胞用抗CD81抗体（绿色）和抗PB1抗体（红色）染色。图像是共焦XY横截面。比例尺：10µm。B） CD81被纳入Udorn感染细胞的出芽丝状病毒中。用Udorn病毒感染A549细胞16小时，并用抗CD81抗体和抗PB1抗体进行染色。比例尺：10µm。C） CD81敲除细胞中剩余的CD81被并入Udorn感染细胞的出芽丝状病毒中。与（B）类似，只是使用了CD81敲除细胞。根据100多个细胞的共焦图像计算Udorn-感染细胞中CD81的表达水平，发现与对照细胞相比，CD81缺失后CD81表达水平降低了约88%。与未经处理的细胞相比，每个病毒丝的CD81数量减少了63%。比例尺：10µm。
图6
图6。CD81在出芽病毒的特定亚病毒位点富集，CD81敲除可破坏病毒的裂解。
A） CD81基因敲除不会改变附着在感染细胞上的出芽病毒的数量。用WSN病毒感染siRNA处理的细胞，用酸旁路处理15小时。细胞被直接固定用于透射电子显微镜，每个细胞横截面上的出芽病毒粒子数量被量化为250多个截面，并显示在点图中。一个双尾学生t检验执行，并提供p值。B） CD81敲除导致释放的病毒颗粒数量大幅减少。将siRNA处理的细胞感染WSN病毒，并进行17小时的酸化处理。用ELISA法检测上清液中病毒M1蛋白的含量。用免疫荧光成像法计数上清液中M1阳性和HA阳性病毒颗粒的数量。误差线是三个独立测量值的标准偏差。C） CD81定位于生长中的X-31病毒在早期萌芽阶段的尖端。细胞用X-31感染12小时，并且CD81被免疫金标记用于电子显微镜。白框中区域的放大图像显示在右上角。比例尺：100 nm。D） CD81主要定位于X-31病毒出芽后期的尖端和出芽颈部。与（C）相似，但感染时间为16小时。比例尺：200 nm。E） 感染后16小时含金颗粒在出芽X-31病毒中的分布。为了对齐病毒粒子，每个病毒的长度被规范化为1，其中点被指定为坐标值0。对于萌芽病毒上的单个金粒子，它们的坐标值是根据它们到中点的相对距离计算的。负值坐标对应于靠近质膜的位置。共分析了105种萌芽病毒。F） 在对照siRNA处理的细胞中，新生WSN病毒呈球形，膜被完全封闭。将病毒感染A549细胞并进行酸-旁路处理13小时。白色框中的区域被放大并显示在右上角。比例尺：200 nm。G） 新生WSN病毒在CD81 siRNA处理的A549细胞中更为伸长。很大一部分出芽病毒具有与质膜相连的开放膜颈（箭头所示）。白色框中的区域被放大并显示在右上角。比例尺：200 nm。H） 出芽WSN病毒在CD81缺失时被拉长，如对照细胞或CD81敲除细胞中出芽病毒长度的分布所示。
图7
图7。CD81沿着出芽丝状Udorn病毒分散分布。
A） CD81沿着Udorn病毒出芽的丝状体定位。A549细胞被Udorn病毒感染18小时，CD81被免疫金标记用于电子显微镜。这里显示的是从细胞中出芽的一束病毒丝（为了放大病毒丝，未显示细胞）。比例尺：200纳米。B） CD81和病毒PB1蛋白似乎沿丝状Udorn病毒呈交替分布。A549细胞感染Udorn病毒16小时，并用抗CD81（绿色）和抗PB1（红色）抗体进行免疫染色。CD81用Alexa Fluor 405/Alexa Fuor 647结合二级抗体进一步探测，PB1用Atto 488结合抗体标记，用于双色3D STORM成像。B-1）和B-2）中显示了两种丝状病毒。左：xy投影图像。中）xz投影图像。右）CD81和PB1沿灯丝长轴的局部分布。比例尺：500 nm。
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