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。2014年3月；59（3）:1118-29。
doi:10.1002/hep.26768。 Epub 2014年1月27日。

小鼠或人肝星状细胞外泌体中MicroRNA-214对结缔组织生长因子的表观遗传调控

李晨 1, 艾莉莎·查瑞尔, 于舟, 陈如菊, 薄玉, 基蒂·阿加瓦尔, 冢本秀一（Hidekazu Tsukamoto）, L詹姆斯·李, 迈克尔·保莱提斯, 大卫·R·布里斯托克
附属公司

小鼠或人肝星状细胞外泌体中MicroRNA-214对结缔组织生长因子的表观遗传调控

李晨等。 肝病学。 2014年3月。

摘要

结缔组织生长因子（CCN2）驱动肝星状细胞（HSC）的纤维化。在这里，我们表明，CCN2在纤维化或脂肪变性肝脏，或在培养激活或乙醇处理的原代小鼠HSC中的上调与microRNA-214（miR-214）的相互下调相关。通过使用保护者或报告者分析来研究CCN2 mRNA的3’-非翻译区（UTR），我们发现通过纤维素酶诱导刺激在HSC中诱导CCN2表达是由于miR-214的表达减少，否则通过直接与CCN2 3’-UTR结合来抑制CCN2的表达。此外，miR-214存在于HSC外泌体中，是双膜囊泡，直径50-150 nm，带负电荷（-26 mV），CD9阳性。通过用外显体抑制剂GW4869预处理细胞，外显体中的MiR-214水平降低，但细胞裂解物中的MiR-214水平没有降低。静止HSC或miR-214转染活化HSC与CCN2 3'-UTR荧光素酶报告基因转染受体HSC共培养，导致miR-214-和exosome依赖性调节野生型CCN2 3’-UTR报告基因，但没有miR-214-结合位点的突变CCN2 3+-UTR报道基因。HSC的外显子是小鼠原代肝细胞摄取miR-214的通道。miR-214对CCN2表达的下调也发生在人LX-2 HSC中，与人CCN2 3'-UTR中保守的miR-214结合位点一致。LX-2细胞中的MiR-214通过外泌体转运至受体LX-2或人类HepG2肝细胞，导致CCN2 3'-UTR活性或CCN2下游靶点（包括α-平滑肌肌动蛋白或胶原）的表达受到抑制。小鼠实验性纤维化与循环miR-214水平降低有关。

结论：miR-214的外体转移是调控CCN2依赖性纤维化发生的范例，并将纤维化途径确定为外体miR调控细胞间的靶点。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突：没有作者需要声明任何冲突。

数字

图1
图1。miR-214和CCN2在肝组织或HSC中的相互表达
通过RT-PCR评估CCN2 mRNA或miR-214的肝脏表达，并在术后将其归一化为GAPDH mRNA（A）给药4周的乙醇或（B）5周服用CCl4与载体对照（n=3个独立实验，一式三份*P（P）<0.001, +P（P）<0.05 vs.无治疗）。（C）油处理对照组CCN2、αSMA、结蛋白或胶原α1的免疫组织化学检测4-治疗小鼠。标本也用DAPI核染色（蓝色）染色（D）油处理对照小鼠肝脏或CCl纤维沉积物附近miR-214的ISH4-治疗小鼠；假定的HSC被圈出，并且在纤维化小鼠中显示miR-214（紫色）染色减少。比例尺：10微米。（E）HSC从正常小鼠分离后培养1天的ISH(左边)或最后两次加油或CCl后36小时4注射间隔48小时(正确的)。标记探针用于检测miR-214（绿色）、GFAP（红色）、αSMA（红色）或CCN2（红色）(左下、右上或右下)或一个加扰序列(左上角)。标本也用DAPI核染色（蓝色；左边)。ISH图像是3个独立实验的代表。比例尺：20微米。（F）从油或CCl中分离后培养第1天从HSC提取的mRNA的RT-PCR，一式三份4-治疗小鼠（E）（n=6只/组）。
图2
图2。小鼠HSC中CCN2生成的MiR-214依赖性
（A）CCN2 mRNA或miR-214的RT-PCR，标准化为GAPDH mRNA，在第3天后，将原代小鼠HSC在1%血清中孵育24小时，然后用0–100mM乙醇处理48小时（n=5个独立实验，一式三份*P（P）<0.001与非治疗+P（P）<0.01 vs.非治疗）。（B）通过RT-PCR评估CCN2 mRNA或miR-214的表达，并将其归一化为GAPDH mRNA，在从正常小鼠肝脏分离的HSC原代培养20天以上（n=4个独立实验，一式三次*P（P）<0.001 vs.第1天CCN2表达#P（P）<0.001 vs.第1天miR-214表达）。（C）CCN2或胶原α1（I）mRNA或miR-214的RT-PCR(插入）相对于通过细胞分选收集的RFP阳性HSC中的GAPDH mRNA，或（D）通过间接免疫荧光（绿色）检测CCN2蛋白，或通过直接荧光（红色）检测转染pLemiR-214或单独转染CCN2 3′-UTR保护剂转染24小时的P6 HSC中RFP蛋白。使用阴性保护剂作为对照（n=4个独立实验，一式三份*P（P）<0.001 vs对照组）。CCN2的RFP荧光（红色）和间接免疫荧光（绿色）（E）αSMA（白色）或（F）P6中的胶原α1（白色）控制HSC或用pLemiR-214转染24小时后。在（D–F），蓝色为DAPI核染色。比例尺：20微米。
图3
图3。CCN2 3′-UTR作为miR-214直接靶点的鉴定
（A）用亲本Fire-Ctx（“Vector”）或含有野生型小鼠CCN2 3′-UTR（“UTR-WT”）的Fire-Ctx转染P6小鼠HSC。一些细胞与前mir-214共转染和/或用CTX处理。在第4天用CytoSelect测定细胞活力，通过480nm/520nm的细胞裂解物荧光进行评估™（n=4个独立实验，一式三份*P（P）<0.001, +P（P）<0.05 vs.无CTX治疗）。（B）P6造血干细胞按照（A）但有些培养物转染了含有CCN2 3′-UTR的Fire-Ctx，miR-214结合位点发生替换突变（“UTR-Mut.”）。（n=4个独立实验，一式三份*P（P）<0.001 vs.无CTX治疗）。（C、D）P6 HSC被视为（B）转染36小时后，测定Fire-Ctx质粒中双荧光素酶报告子的活性。细胞裂解物中的萤火虫荧光素酶活性标准化为Renilla荧光素酶（n=4个独立实验，一式三次*P（P）<0.001 vs.无前mir-214转染，#P（P）<0.001 vs.矢量）。
图4
图4。小鼠HSC-衍生外泌体的鉴定和表征
通过从P6小鼠HSC连续离心条件培养基分离外泌体。（A）透射电镜(左边)和低温TEM(正确的).比例尺：100纳米（左），50纳米（右）。（B）动态光散射和zeta电位分析，显示存在约140nm粒子（−26mV）。插入：CD9 Western blot。（C）3小时或36小时后，从对照细胞或mir-214前转染细胞分离的细胞或外体microRNA的RT-PCR，归一化为细胞GAPDH。（n=4个独立实验，一式三份*P（P）与对照组相比<0.001）。3小时时，对照细胞内生外体miR-214的Ct值=38。（D）用GW4869治疗24小时后，通过RT-PCR评估miR-214前转染HSC的细胞或外体miR-214水平，数据归一化为细胞GAPDH。（n=4个独立实验，一式三份+P（P）与对照组相比<0.05）。（E）在存在或不存在10μM GW4869的情况下，对照组或mir-214转染前的HSC中CCN2或胶原α1（I）的表达。
图5
图5。通过miR-214的外体转运实现HSC-HSC细胞间信号传递
（A）HSC供体和受体共培养实验如支持图S4所示。用GFP-CD9（绿色）和RFP-miR-214（pLemiR-214；红色）质粒共转染供体P6小鼠HSC，并在有或无GW4869的情况下培养。受体细胞为未转染P6小鼠HSC。显示供体和受体细胞的代表性免疫荧光图像（n=3个独立实验）比例尺：20微米。（B）用含有野生型或突变体CCN2 3′-UTR的Fire-Ctx质粒转染的受体P6小鼠HSC（图3A，B，支持图S1A，S4B）在存在或不存在GW4869的情况下与对照或前mir-214转染的供体P6-HSC共同孵育。在对照实验中，一些受体HSC暴露于微Well的供体侧，该微Well缺乏供体HSC，但在与供体HSC-转染相同浓度（100nM）的培养基中含有前mir-214。将中央分隔器从微Well中移除24小时后，显示了受体细胞裂解液中萤火虫荧光素酶的活性，并将其归一化为Renilla荧光素酶的活性。（n=4个独立实验，一式三份+P（P）与对照组相比<0.05）。（C）HSC共培养实验的建立和评估如下（B）除了供体HSC是从正常小鼠肝脏中新鲜分离出来的，并在GW4869治疗前培养1天（n=4个独立实验，一式三份*P（P）<0.001 vs.矢量#P（P）<0.001 vs.UTR-WT）。（D）在对照或mir-214转染前的P6供体HSC（±GW4869）和P6受体细胞（支持图S4B）之间建立共培养12小时，然后对后者进行评估，以进行CCN2（绿色）、I型胶原（红色）或αSMA（白色）的免疫细胞化学检测。蓝色表示DAPI核染色。比例尺：20微米。（E）添加从48hr条件培养基分离的外显子24小时后，CCN2或miR-214在P6 HSC中的表达。（F）从接受两次油或CCl注射的瑞士韦伯斯特小鼠分离的HSC 24小时条件培养基的外泌体中的MiR2144（蛋白质印迹显示在外泌物提取物中检测到flotillin或CD9）(左）或来自瑞士韦伯斯特小鼠的血清4持续5周(正确的)（*P<0.001 vs油组）。
图6
图6。人HSC产生的miR-214的功能表征
（A）用25mM乙醇处理缺血清的LX-2 HSC 48小时后CCN2和miR-214的相互表达。RNA进行RT-PCR，CCN2或miR-214的表达归一化为GAPDH的表达。（n=5个独立实验，一式三份*P（P）<0.001 vs非治疗）。（B）转染前mir-214后LX-2细胞CCN2表达下调，测定如下（A）（n=5个独立实验，一式三份+P（P）与对照组相比<0.05）。（C）从LX-2细胞条件培养基纯化的外泌体TEM。比例尺：100纳米。（D）在存在或不存在GW4869的情况下，用pre-mir-214转染供体LX-2细胞。一些供体孔在培养基中含有前mir-214，但没有LX-2细胞。受体为转染了Fire-Ctx质粒的LX-2细胞，该质粒为亲本或含有野生型或突变CCN2 3′-UTR（支持图S4B）。在共培养24小时后在细胞裂解物中测量萤火虫萤光素酶活性，并将其标准化为雷尼拉萤光素酶的活性。（n=4个独立实验，一式三份+P（P）与对照组相比<0.05）。（E）共焦显微镜显示小鼠原代肝细胞在与预先标记PKH26的P6 HSC分泌的外泌体孵育4小时后对外泌物的摄取(上面的)或从用pLemiR-214转染的P6-HSC的培养基中分离的(降低);比例尺：10微米。（F）在mir-214转染前供体LX-2细胞（±GW4869）和转染含有野生型CCN2 3′-UTR的Fire-Ctx质粒的受体HepG2细胞之间建立共培养24小时（支持图S4B）。荧光素酶在细胞裂解物中测定，如（D）（n=4个独立实验，一式三份+P（P）与对照组相比<0.05）。
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    1. 黄G，Brigstock DR。结缔组织生长因子对肝星状细胞的调节。Front Biosci公司。2012;17:2495–2507。-公共医学
    1. Abou-Shady M、Friess H、Zimmermann A、di Mola FF、Guo XZ、Baer HU等。人类肝硬化中的结缔组织生长因子。肝脏。2000;20:296–304.-公共医学

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