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.2013年9月30日；8（9）：e74783。
doi:10.1371/journal.pone.0074783。 2013年电子收集。

线粒体谷氨酰胺酶C的小角度X射线散射研究揭示了延伸的柔性区域，并将寡聚状态与酶活性联系起来

玛格达·默勒 1, 瑟伦·斯尼尔森, 塞卡尔·拉马钱德兰, 李云兴, 吉安卡洛·特里亚, 沃纳·斯特里彻, 马克西姆·佩图霍夫, 理查德·塞里奥, 理查德·吉利兰, 本特·维斯特加德
附属公司

线粒体谷氨酰胺酶C的小角度X射线散射研究揭示了延伸的柔性区域，并将寡聚状态与酶活性联系起来

玛格达·默勒等。 公共科学图书馆综合版. .

勘误表in

  • 公共科学图书馆一号。2013;8(12). doi:10.1371/annotation/80d64df5-065e-4be9-a4e8-31c4cba67114。李宇兴[改为李宇兴]

摘要

谷氨酰胺酶C是一种关键的代谢酶，在许多癌症系统中不受调节，并被认为在Warburg效应中起着核心作用，癌细胞通过这种效应改变代谢特征。一个长期存在的假设将酶活性与蛋白质低聚物状态联系在一起，因此，研究一般溶液行为，尤其是谷氨酰胺酶C的低聚物态，对于理解蛋白质激活和抑制的机制非常重要。在本报告中，使用高通量微流控芯片收集SAXS数据，对这一现象与酶浓度或磷酸盐水平的相关性进行了广泛研究，我们确认低聚物状态与活性相关。深入的溶液行为分析进一步揭示了蛋白质在二聚体、四聚体和八聚体状态下柔性区域的结构行为，并研究了C末端对酶溶液行为的影响。我们的数据使基于SAXS的全长四聚体状态刚体建模成为可能，从而提出了第一个实验推导的线粒体谷氨酰胺酶C的结构模型，包括酶的N端和C端。

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利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。SAXS数据和基本生物物理参数。
a）应用微流控芯片采集GACwt和GACΔC蛋白浓度稀释系列的SAXS强度曲线。绘制的强度曲线减去背景并与浓度归一化。蓝色虚线表示GACwt的数据，橙色实线表示GACΔC的数据。b）MW和R克根据蛋白质浓度绘制SAXS数据中蛋白质浓度筛选数据的测定值。实线表示R克值，虚线表示MW值。c）应用微流控芯片采集了GACwt和GACΔC磷酸盐滴定系列的SAXS强度曲线。GACwt的蛋白质浓度保持在30.7µM，GACΔC的蛋白质浓度维持在33.8µM。绘制的强度曲线减去背景并与浓度归一化。蓝色虚线表示GACwt的数据，橙色实线表示GACΔC的数据。d）MW和R克根据用于磷酸盐浓度筛选的SAXS数据的测定相对于蛋白质浓度绘制。
图2
图2。基于SAXS的溶液系统灵活性和低聚物状态分析。
a） 描绘EOM估计的低聚物分布（图例中用E标记）、二聚体和四聚体的SASRFMX分布（用S标记）和低聚物分析估计的GACwt在x轴上以µM单位给出的分析蛋白质浓度下的分布（用O标记）的条形图。b）描绘EOM估计低聚物分布（标记为E）和低聚物分析估计GACΔC在x轴上以µM单位给出的分析蛋白质浓度下的分布（标记有O）的条形图。对于a）和b），通过采用最适合实验曲线的结构来估计EOM-导出的分布。c）条形图显示了oligomer分析得出的低聚物分布，作为GACwt磷酸盐滴定筛选的体积分数。d）条形图显示寡聚物分布作为GACΔC磷酸盐滴定屏幕的体积分数。e）GACwt浓度筛选的EOM分析。对克与结构库相对应的GACwt分布（给定的二聚体、四聚体和八聚体库以绿色显示）。f）GACΔC浓度屏幕的EOM分析。对克与结构库相对应的GACΔC分布（给定的二聚体、四聚体和八聚体库以绿色显示）。
图3
图3。谷氨酰胺酶C四聚体3D低分辨率溶液结构。
GACwt四聚体的刚体模型从三个不同方向显示。使用SASREFMX程序结合原子分辨率结构（pdb代码3ss3.pdb）和GACwtCs数据计算3D结构。粉红色和绿色显示的区域是柔性区域，因此刚体模型只是解决方案中通常可以找到的结构的示意图。右下角的图显示SASREFMX与计算中总共八条散射曲线中的三条曲线的实验数据相吻合。可以将模型与计算的模型进行比较，同时排除最高浓度数据（文件S1中的图S7）。
图4
图4。基于MALS和AUC的溶液低聚物状态分析。
a）GACwt的MALS数据显示蛋白质溶液中低聚物物种的质量分数，蛋白质浓度范围为1.4µM至9.7µM，如在MALS上检测到的，估计Rz（z）x轴上给出的值（RMS半径）。图例中给出了主峰的洗脱浓度。误差栏表示计算的拟合误差。b）GACwt的MALS数据显示蛋白质低聚物状态的磷酸依赖性变化。MALS上检测到的物种质量分数，估计Rz（z）x轴上给出的值。所有样品的蛋白质浓度保持在31µM。误差栏表示计算的拟合误差。c）GACwt构建物的AUC沉降速度数据显示寡聚状态的蛋白质浓度依赖性分布。根据S值绘制获得的连续尺寸分布，并根据20°C（S）下的缓冲液密度和粘度进行校正w20型)，对于图中所示的不同蛋白质浓度。d）GACwt活性的无机磷酸盐依赖性。数据显示为三个独立实验的平均+/-SD。通过检查绘制穿过数据点的线。
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