Proline oxidase-adipose triglyceride lipase pathway restrains adipose cell death and tissue inflammation

doi:10.1038/cdd.2013.137

.2014年1月；21(1):113-23.

doi:10.1038/cdd.2013.137。 Epub 2013年10月4日。

脯氨酸氧化酶-二糖甘油三酯脂肪酶途径抑制脂肪细胞死亡和组织炎症

D莱蒂埃里·巴巴托¹, K阿奎拉诺, S巴尔德利, S M卡纳塔, S贝尔纳迪尼, G Rotilio公司, M R Ciriolo先生

附属公司

PMID： 24096872
预防性维修识别码：下午3点857628分
内政部： 10.1038/cdd.2013.37

脯氨酸氧化酶-二糖甘油三酯脂肪酶途径抑制脂肪细胞死亡和组织炎症

D莱蒂埃里·巴巴托等。细胞死亡差异. 2014年1月.

.2014年1月；21(1):113-23.

doi:10.1038/cdd.2013.137。 Epub 2013年10月4日。

作者

D莱蒂埃里·巴巴托¹, K阿奎拉诺, S巴尔德利, S M卡纳塔, S贝尔纳迪尼, G Rotilio公司, M R Ciriolo先生

附属

¹意大利罗马托尔韦加塔大学生物系，通过della Ricerca Scientifica，00133 Rome，Italy。

PMID： 24096872
预防性维修识别码：项目经理3857628
内政部： 10.1038/cdd.2013.37

摘要

营养敏感脂解酶脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）在脂肪组织功能中起着关键作用，其活性的改变与许多与年龄相关的代谢紊乱有关。脂肪组织中血管密度降低与缺氧状态、细胞死亡和炎症有关。在这里，我们证明了血管化不良的肥大内脏脂肪组织（即老年小鼠的脂肪组织）的脂肪细胞受到有限的营养输送。特别是，营养素饥饿导致线粒体脯氨酸氧化酶/脱氢酶（POX/PRODH）活性增加，这是触发ATGL的ROS依赖性诱导的原因。我们证明ATGL促进与线粒体氧化代谢相关的基因的表达（过氧化物酶体增殖物激活受体-α、过氧化物质体增殖物活化受体-γ辅活化因子-1α），从而实现向脂肪利用的代谢转换，为饥饿的脂肪细胞提供能量并防止细胞死亡，以及脂肪组织炎症。综上所述，这些结果确定ATGL是脂肪细胞中的一种应激抵抗介质，抑制了典型的年龄相关代谢障碍的内脏脂肪组织功能障碍。

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数字

图1
老年小鼠和营养缺乏的3T3-L1脂肪细胞的内脏AT中ATGL增加。(一)对年轻（2个月）和老年（16个月）小鼠内脏AT总蛋白提取物中的VEGF-A、VE-cadherin和PECAM-1进行Western blotting分析(b条)年轻和老年小鼠内脏AT凋亡的免疫荧光分析。细胞核用Hoechst 33342（蓝色）染色，凋亡细胞核用TUNEL分析（红色）显示。合并图像中的白色箭头表示细胞核凋亡。凋亡以TUNEL阳性细胞的百分比表示（右侧）(n个=每组5只小鼠）。(**c（c）**)Western blotting分析不同饥饿时间3T3-L1脂肪细胞总蛋白提取物中的ATGL、HSL和MGL。(d日)RT-qPCR分析不同饥饿时间3T3-L1的相对ATGL mRNA水平。(**e（电子）**)对年轻和老年小鼠内脏AT总蛋白提取物中的ATGL、HSL和MGL进行Western blotting分析(**（f）**)饥饿8小时后（Stv），3T3-L1脂肪细胞在完全细胞培养基（CM）中培养24小时。ATGL蛋白和mRNA的蛋白质印迹（上图）和RT-qPCR（下图）分析(克)左上角：年轻、老年和老年小鼠CR（old-CR）后H&E染色内脏AT的组织切片。黑色箭头表示血管。酒吧：100μm.左下图：总蛋白提取物中PECAM-1和ATGL的蛋白质印迹分析。β-肌动蛋白作为负荷控制。右上角：幼年、老年和老年小鼠的内脏AT重量（old-CR）表示为体重百分比。右下面板：血管密度表示为每1mm的血管数²(n个=每组5-6只小鼠）。所有数值均为平均值±S。D**P（P）*<0.05, ***P（P）*<0.01与控制；°*P（P）*<0.05, °°*P（P）*<0.01与饥饿治疗。体外数据代表了至少三个独立实验

图2
FoxO1以ROS依赖的方式诱导ATGL表达。(一)不同饥饿时间3T3-L1脂肪细胞中FoxO1总蛋白、核蛋白和细胞质蛋白提取物的Western blotting分析。(b条,**c（c）**)用FoxO1抗体对3T3-L1饥饿6 h的脂肪细胞和年轻和老年小鼠内脏AT的交联核进行ChIP检测，然后对FoxO1RE进行qPCR分析*pnpla2*启动子（−1101）。虚线表示IgG控制值。在饥饿前1小时添加NAC（5 mM），并在整个实验期间保持。另请参见补充图S3。(d日)青年和老年小鼠内脏AT中ATGL mRNA相对水平的RT-qPCR分析*（n）*=每组5只小鼠）。(**e（电子）**,**（f）**)FoxO1和ATGL总蛋白的Western blotting分析(**e（电子）**)和核蛋白提取物(**（f）**)饥饿6h的脂肪细胞。饥饿前1小时添加NAC（5 mM）或Trolox（0.5 mM），并在整个实验期间保持。(克)饥饿6h的3T3-L1脂肪细胞相对ATGL mRNA水平的RT-qPCR分析。(小时,我)用小干扰RNA（siRNA）转染3T3-L1脂肪细胞以对抗FoxO1（FoxOl（−））或干扰siRNA（Scr）。饥饿6h的3T3-L1脂肪细胞中相对ATGL mRNA水平的RT-qPCR分析和FoxO1和ATGL的western blotting分析。LDH、Sp1和β-肌动蛋白被用作负荷控制。所有数值均为平均值±S。D**P（P）*<0.05, ***P（P）*<0.01与控制。体外数据代表了至少三个独立实验

图3
线粒体ROS激活3T3-L1脂肪细胞中FoxO1介导的ATGL诱导。(一)用线粒体ROS敏感探针（MitoSox）孵育6h饥饿3T3-L1脂肪细胞的细胞荧光分析。在饥饿前1小时添加NAC（5 mM），并在整个实验期间保持。(**b–e类**)FoxO1和ATGL的蛋白质印迹(b条,d日)和相对ATGL mRNA水平的RT-qPCR(**c（c）**,**e（电子）**)鱼藤酮处理的3T3-L1脂肪细胞（1μM）或cccp（10μM） ●●●●。(**（f）**)鱼藤酮处理的3T3-L1脂肪细胞的FoxO1总蛋白、核蛋白和细胞质蛋白提取物的蛋白质印迹分析。(克,小时)FoxO1和ATGL总蛋白的Western blotting分析(克)和核能(小时)用鱼藤酮或cccp处理16h的3T3-L1脂肪细胞的蛋白质提取物。在鱼藤酮或cccp处理前1 h添加NAC（5 mM），并在整个实验期间保持。(我)鱼藤酮处理（16 h）后，使用FoxO1抗体对3T3-L1脂肪细胞的交联细胞核进行ChIP分析，然后对FoxO1RE进行qPCR分析*pnpla2*启动子（−1101）。虚线表示IgG控制值。在饥饿前1小时添加NAC（5 mM），并在整个实验期间保持。(j个)RT-qPCR分析鱼藤酮或cccp处理16h的3T3-L1脂肪细胞中的相对ATGL mRNA水平。在鱼藤酮或cccp处理前1 h添加NAC（5 mM），并在整个实验期间保持。(k个,我)用小干扰RNA（siRNA）转染3T3-L1脂肪细胞以对抗FoxO1（FoxOl（−））或干扰siRNA（Scr）。相对ATGL mRNA水平的RT-qPCR分析(k个)FoxO1和ATGL的免疫印迹分析(我)用鱼藤酮或cccp处理3T3-L1脂肪细胞16小时。β-肌动蛋白、LDH、H2B和Sp1作为负荷对照。所有数值均为平均值±S。D**P（P）*<0.05, ***P（P）*<0.01与控制；°*P（P）*<0.05, °°*P（P）*<0.01与鱼藤酮和cccp处理。体外数据代表了至少三个独立实验

图4
POX活性在饥饿期间增加，并触发3T3-L1脂肪细胞中ROS介导的FoxO1-ATGL轴。(一)饥饿不同时间3T3-L1脂肪细胞中POX的酶活性。(b条)不同饥饿时间3T3-L1脂肪细胞蛋白质提取物中POX的蛋白质印迹分析。免疫反应带的相对密度报告为POX/β-actin（底部面板）。(**c（c）**,d日)蛋白质印迹分析(**c（c）**)和酶活性(d日)受CR（old-CR）影响的年轻、老年和老年小鼠内脏AT中POX的含量。POX活性表示为相对于年轻人的增加百分比(n个=每组5-6只小鼠）。(**e（电子）**)用小干扰RNA（siRNA）转染3T3-L1脂肪细胞以对抗POX（POX（−））或干扰siRNA（Scr）转染（上图）。用线粒体ROS敏感探针（MitoSox）孵育6h饥饿3T3-L1脂肪细胞的细胞荧光分析（底图）。(**（f）**)来自6小时饥饿的3T3-L1脂肪细胞的总蛋白提取物中FoxO1和ATGL的蛋白质印迹分析。(克)饥饿6h的3T3-L1脂肪细胞的细胞质（Cyt）和核（Nuc）蛋白提取物中FoxO1的Western blotting分析。β-肌动蛋白、Sp1和乳酸脱氢酶作为负荷对照。所有数值均为平均值±S。D**P（P）*<0.05, ***P（P）*<0.01与控制。体外数据代表了至少三个独立实验

图5
ATGL上调与脂肪细胞线粒体氧化代谢增加有关。(一)通过尼罗河红（左侧）或油红O（右侧）染色测定饥饿6h的3T3-L1脂肪细胞中的TG含量。细胞核用Hoechst 33342（蓝色）染色。洗脱后检测油红O吸光度。显示了油红O吸光度值的平均值。(b条)测定不同饥饿时间3T3-L1脂肪细胞中的细胞外脂肪酸浓度。数据报告为相对于控制的增加百分比。(**c、 d日**)相对PPAR的RT-qPCR分析αmRNA水平(**c（c）**)Aco2和PGC-1的免疫印迹分析α(d日)在不同饥饿时间的3T3-L1脂肪细胞中。(**e（电子）**)相对PPAR的RT-qPCR分析α，PGC-1α青年和老年小鼠内脏AT中Aco2和CPT-1b mRNA的水平(n个=每组5只小鼠）。(**（f）**)年轻和老年小鼠内脏AT中柠檬酸合成酶的酶活性。柠檬酸合成酶活性以相对于年轻小鼠的增加百分比表示(n个=每组5只小鼠）。(克)用抗ATGL[ATGL（-）]的小干扰RNA（siRNA）或干扰siRNA（Scr）转染3T3-L1脂肪细胞。相对PPAR的RT-qPCR分析α，第1页α饥饿8h的3T3-L1脂肪细胞中Aco2和CPT-1b mRNA水平。(小时)饥饿8h的3T3-L1脂肪细胞中ATGL和FoxO1的Western blotting分析。β-肌动蛋白被用作负荷控制。所有数值均为平均值±S。D**P（P）*<0.05, ***P（P）*<0.01, °*P（P）*<0.05与控制。体外数据代表至少3个独立实验

图6
ATGL缓冲饥饿诱导的能量应激，防止脂肪细胞死亡和AT炎症。(一)PARP-1、裂解caspase-9和TNF的Western blotting分析α幼龄、老年和老年CR小鼠内脏AT总蛋白提取物中）。(b条)ATGL、PARP-1、裂解caspase-9和TNF的Western blotting分析α幼年（2个月）野生型（y-WT）和ATGL-KO（y-ATGL-KO）小鼠内脏AT的总蛋白提取物。(**c（c）**)相对肿瘤坏死因子的RT-qPCR分析α、IL-6和IL-1β幼年（2个月）野生型（y-WT）和ATGL-KO（y-ATGL-KO）小鼠内脏AT的mRNA水平(n个=每组5只小鼠）。(d日)2月龄野生型（y-WT）和ATGL-KO（y-ATGL-KO）小鼠初级前脂肪细胞总蛋白提取物中ATGL、PARP-1和裂解caspase-9的Western blotting分析。(**e（电子）**)不同饥饿时间3T3-L1脂肪细胞总蛋白提取物中PARP-1和裂解半胱天冬酶-9的Western blotting分析。(**（f）**)用抗ATGL的小干扰RNA（siRNA）（ATGL（−））或干扰siRNA（Scr）转染3T3-L1脂肪细胞。对饥饿8h的3T3-L1脂肪细胞总蛋白提取物中的PARP-1和裂解半胱天冬酶-9进行蛋白质印迹分析。(克)饥饿8和16小时的ATGL（−）和Scr 3T3-L1脂肪细胞培养液中LDH的酶活性。LDH活性表示为相对于Scr的增加百分比。(小时,我)16小时饥饿ATGL（−）和Scr 3T3-L1脂肪细胞ATP水平的化学发光分析(小时)和年幼和年老小鼠内脏AT(我). ATP水平表示为pmol ATP/mg prot。(我) (N个=每组5只小鼠）。β-肌动蛋白被用作负荷控制。所有数值均为平均值±S。D**P（P）*<0.05, ***P（P）*<0.01与控制。体外数据代表了至少三个独立实验

图7
有限营养物质输送后脂肪细胞中激活的分子途径示意图。老龄化与内脏AT的血管化减少有关。常驻脂肪细胞的营养供给有限，并通过新陈代谢适应这种情况，以防止能量灾难。营养缺乏时，ATGL上调对通过增加线粒体脂质氧化来防止脂肪细胞死亡和AT炎症至关重要。线粒体脯氨酸氧化酶产生的ROS是FoxO1依赖性ATGL表达的上游介质。ATGL代表脂肪细胞中的一种应激抵抗介质，抑制典型的年龄相关代谢障碍的AT功能障碍。AT，内脏脂肪组织；脂肪甘油三酯脂肪酶；CPT1b，肉碱棕榈酰转移酶1b；FoxO1，叉头盒蛋白O1；FoxO1RE，FoxO1-响应元件；氧化磷酸化；*pnpla2*，含有2个patatin-like磷脂酶结构域；脯氨酸氧化酶；PRO，脯氨酸；P5C，吡咯烷5羧酸盐；活性氧；甘油三酯

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