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.2013年10月3日；4（10）：e831。
doi:10.1038/cddis.2013.347。

不同疾病阶段肝细胞癌患者循环肿瘤细胞中表达的上皮-间充质转换标记物

Y-M李 1, S-C徐, J李, K-Q汉族, H-F Pi公司, L Zheng先生, G-H左, X-B黄, H-Y李, H-Z赵, Z-P于, Z Zhou先生, P Liang先生
附属公司

不同疾病阶段肝细胞癌患者循环肿瘤细胞中表达的上皮-间充质转换标记物

Y-M李等。 细胞死亡病. .

摘要

外周血中循环肿瘤细胞（CTC）的存在与肝细胞癌（HCC）患者的转移和预后相关。上皮-间充质转化（EMT）在肿瘤侵袭和扩散中起着关键作用。为了确定评估转移和预后的更敏感的生物标记物，我们研究了EMT标记物的表达，包括波形蛋白、twist、ZEB1、ZEB2、snail、slug和E-cadherin在CTC、原发性肝癌和邻近非肿瘤肝组织中的表达。用去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）从肝癌患者外周血中分离出活的CTC后，用免疫荧光染色鉴定CTC。在60例HCC患者中，46例（76.7%）的外周血中检测到CTC。三重免疫荧光染色显示，从46例患者中分别获得39例（84.8%）和37例（80.4%）的CTC，可以检测到twist和vimentin的表达。CTC中twist和vimentin的表达与门静脉癌栓显著相关。在46例患者中，32例（69.6%）CTC中检测到twist和vimentin的共表达，与门静脉癌栓、TNM分级和肿瘤大小高度相关。定量荧光western blot分析显示，肝癌组织中E-cadherin、vimentin和twist的表达水平与分离的CTC的阳性率显著相关（P=0.013，P=0.012，P=0.009）。然而，在CTC、原发性肝癌和相邻非肿瘤肝组织中，ZEB1、ZEB2、蜗牛和蛞蝓的表达水平在临床病理参数方面没有显著差异。我们的结果表明，EMT在促进原发性肝癌细胞的血行播散中发挥作用，CTC中twist和vimentin的表达水平可以作为评估肝癌患者转移和预后的有希望的生物标志物。

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数字

图1
图1
流式细胞术分析证实了生物素化无唾液酸胎球蛋白与ASGPR的特异性结合。HepG2、MHC97H、PLC、SMMC-7721和SK-Hep1是表达ASGPR的人肝癌细胞系。人胃癌细胞株MGC-803和HeLa人宫颈腺癌细胞株ASGPR均为阴性。所有细胞均使用生物素化无唾液酸胎球蛋白和抗生物素荧光素异硫氰酸盐（FITC）进行染色，但不包括用PBS和抗生素FITC染色的HepG2细胞，后者作为对照。在HepG2和PLC细胞中敲除ASGPR后，在这两个细胞系中几乎检测不到生物素化的无唾液酸胎球蛋白结合
图2
图2
免疫荧光染色鉴定了不同疾病阶段HCC患者CTC中EMT相关基因的表达。(一)CTC和血液细胞用HSA抗小鼠抗体/Alexa Fluor 647兔抗小鼠IgG（红色）和CD45抗大鼠抗体/Alexa Fluoro 488兔抗大鼠Ig G（绿色）染色。细胞核用DAPI（蓝色）染色。(b条–克)三重免疫荧光显示CTC分别表达波形蛋白、twist、ZEB1、ZEB2、snail和E-cadherin。用兔抗vimentin、twist、ZEB1、ZEB2、snail和E-cadherin的一级抗体对这些CTC进行染色，相应的二级抗体为Alexa Fluor 555驴抗兔IgG（黄色）。其余染色程序与双免疫荧光法相同。条形=10μm.同一患者的CTC中扭曲和波形蛋白共表达。从同一患者不同视野获得的CTC的代表性显微照片。(小时)CTC表达HSA和twist，但不表达CD45。(我)一种CTC，表达HSA和波形蛋白，但不表达CD45。原始放大倍数×800
图3
图3
与邻近的非肿瘤组织相比，原发性HCC肿瘤中EMT相关标志物的表达有显著差异。(A类)E-cadherin在邻近的非肿瘤肝组织（a，b）中高表达，而在肿瘤组织（c，d）中几乎没有E-cadherin的表达。波形蛋白、twist和ZEB1在邻近非肿瘤肝组织（e，f；i，j；m，n）中的表达显著低于原发性肝癌组织（g，h；k，l；o，p）。与相邻的非肿瘤肝组织（q，r）相比，ZEB2在HCC肿瘤（s，t）中的表达更容易下调。蜗牛在邻近非肿瘤肝组织（u，v）和HCC肿瘤（w，x）中的表达没有明显差异。在邻近的非肿瘤肝组织（y，z）或HCC肿瘤中几乎检测不到Slug的表达(α,β). 原始放大倍数×100（a、c、e、g、i、k、m、o、q、s、u、w、y、，α)，巴=100μm.以及放大倍数较高的相应区域×200（b、d、f、h、j、l、n、p、r、t、v、x、z，β)，巴=50μ米(B类)相邻非肿瘤肝组织（TN）和肝癌（T）中E-cadherin、vimentin、twist、ZEB1、ZEB2、蜗牛和蛞蝓蛋白水平的代表性免疫印迹。β-肌动蛋白被用作蛋白质负荷的内部标准。(C类)几个肝癌细胞系和HeLa细胞中E-cadherin、vimentin和twist表达的代表性免疫印迹。(D类)相对定量分析显示，与邻近的非肿瘤肝组织相比，肝癌组织中E-cadherin显著下调(n个=28, **对=0.003). 与邻近的非肿瘤肝组织相比，HCC肿瘤中的波形蛋白、twist和ZEB1表达水平显著上调(n个=28, **对=0.002, ***对<0.001, *对=0.016). 与邻近的非肿瘤肝组织相比，肝癌组织中ZEB2的表达显著降低(n个=28, *对=0.030）。肝癌肿瘤或成对的相邻非肿瘤肝组织中蜗牛和蛞蝓的表达无统计学差异
图4
图4
肝癌中EMT的发生与门静脉癌栓相关，并促进CTC的形成。(一)肝细胞癌中波形蛋白表达的相对水平与E-cadherin表达呈负相关(n个=28,第页=−0.604,对=0.001). (b条)肝癌组织中twist表达的相对水平与E-cadherin表达呈负相关(n个=28,第页=−0.437，对=0.020）。(c（c）)门静脉癌栓患者肝癌组织中E-cadherin的表达显著降低(n个=10）比没有门静脉癌栓的患者(n个=18) (**对=0.007），波形蛋白和twist在HCC肿瘤中的表达在门静脉癌栓患者中显著升高(n个=10）比没有门静脉癌栓的患者(n个=18) (***对<0.001, **对分别为0.004）。其他转录因子的表达与门静脉癌栓无明显相关性。(d日)CTC阳性患者肝癌组织中E-cadherin的表达显著降低(n个=18）比CTC阴性患者(n个=10) (*对=0.013). CTC阳性患者HCC肿瘤中波形蛋白和twist的表达显著增高(n个=18）比CTC阴性患者(n个=10) (*对=0.012, **对分别为0.009）。其他转录因子的表达水平与CTC的阳性率无关
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参考文献

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