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.2013年11月8日；288(45):32528-32538.
doi:10.1074/jbc。M113.500561。 Epub 2013年10月1日。

前转移核糖体S6激酶2-cAMP反应元件结合蛋白（RSK2-CREB）信号通路上调肌动蛋白结合蛋白fascin-1促进肿瘤转移

李丹（Dan Li） 1, 金灵涛 1, 吉娜·N·阿莱西 1, Young-Mee Kim（金永美） 1, 范军（Jun Fan） 1, Jae Ho Seo先生 1, 王东生 1, 梅根·塔克 2, 顾廷磊 2, 本杰明·H·李 三, 杰克·汤顿 4, 凯利·马格里奥卡 5, 卓国晨 1, 董敏欣 1, 法德洛·R·库里 1, 苏敏康 6
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前转移核糖体S6激酶2-cAMP反应元件结合蛋白（RSK2-CREB）信号通路上调肌动蛋白结合蛋白fascin-1促进肿瘤转移

李丹（Dan Li）等。 生物化学杂志. .

摘要

转移是乳腺癌、肺癌和头颈癌患者死亡的主要原因。然而，这些癌症转移的分子机制尚不清楚。我们发现，p90核糖体S6激酶2（RSK2）-cAMP反应元件结合蛋白（CREB）通路在多种转移性人类癌细胞中普遍激活，导致CREB转录靶点Fascin-1上调。我们还观察到RSK2和Fascin-1的蛋白表达模式与头颈部鳞癌患者的原发性人类肿瘤组织样本相关。此外，RSK2的敲除破坏了丝状伪足在高侵袭性癌细胞中的形成和捆绑，导致体外癌细胞侵袭和体内肿瘤转移减弱，而Fascin-1的表达显著挽救了这些表型。此外，用小分子RSK抑制剂FMK-MEA靶向RSK2分别在体外和体内有效地减弱了癌细胞的侵袭和转移潜力。总之，我们的发现首次通过上调Fascin-1将RSK2-CREB信号与丝虫形成和捆绑联系起来，为人类癌症提供了促侵袭和促转移优势。因此，RSK2-CREB-Fascin-1通路的蛋白效应器在转移性人类癌症的临床预后和治疗中代表了有希望的生物标记物和治疗靶点。

关键词：细胞侵袭；细胞迁移；筋膜-1；丝足类；转移；核糖体S6激酶2；丝氨酸苏氨酸蛋白激酶；信号转导；cAMP反应元件结合。

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数字

图1。
图1。
RSK2通过上调促侵袭性Fascin-1激活CREB，促进癌细胞侵袭和迁移。 A类，shRNA稳定击倒RSK2或CREB(下部面板)导致侵袭性显著降低(上部面板)转移细胞系HNSCC 212LN中(左边)，肺癌细胞系A549(中间的)和乳腺癌细胞系SKBR3(正确的).B在基于胶原蛋白的迁移分析中，212LN、A549和SKBR3细胞中RSK2的稳定敲除可减少癌细胞迁移。CRT-PCR检测转移性肺癌A549和HNSCC M4e细胞中一组CREB转录靶点mRNA水平的结果摘要，RSK2或CREB被稳定敲除。使用特异性引物进行一步RT-PCR。计算每个转录靶的mRNA水平，将每个靶带的信号强度归一化为琼脂糖凝胶上相应的GAPDH带。这个数表示具有RSK2敲除或CREB敲除的A549和M4e细胞中每个靶点与具有空载体的对照细胞的mRNA比率。D类实时RT-PCR结果显示，RSK2敲低导致M4e细胞中促转移CREB下游靶点Fascin-1的mRNA水平降低，而非其他CREB转录靶点的mRNA。E类实时RT-PCR结果显示，RSK2敲除导致各种转移性人类肿瘤细胞中Fascin-1 mRNA水平降低。F类RSK2的敲除导致CREB的Ser-133磷酸化减弱，以及高侵袭性212LN、A549和SKBR3细胞中Fascin-1的蛋白表达水平减弱。G公司，RSK2激活筋膜-1荧光素酶报告分析中的基因启动子。这个筋膜-1启动子报告子构建及含有RSK2、Y707A组成活性突变体形式的质粒(加拿大RSK2)共转染293T细胞。24小时后，收集细胞并测定萤光素酶的表达。结果显示为萤火虫萤光素酶活性校正为雷尼利亚RSK2 CA刺激的细胞裂解物中的荧光素酶活性与对照细胞和表达为折叠诱导。所有误差线图中所示为每个样品三次重复的平均值±S.D。对使用Student的t吨测试（*，对= 0.01–0.05; **,对< 0.01). 所提供的Western blot数据来自一个代表多个独立实验的实验。
图2。
图2。
在HNSCC患者的原发性人类肿瘤组织样本中，RSK2、磷酸化CREB和Fascin-1的水平相互关联。 A类，使用101个主要患者组织样本进行IHC分析，包括Tu（Met−），涂（Met+）和LN（Met+）样品(图，肿瘤）。显示了每个人类HNSCC组织样本的RSK2、磷酸化CREB S133和Fascin-1的代表性IHC染色图像。B，表达以加权指数（WI=阳性染色（%）×强度评分（0～3+））表征。RSK2、磷酸化CREB和Fascin-1之间的相关性通过Pearson相关系数使用Graphpad Prism（第6版，GraphpadSoftware，Inc.，加利福尼亚州拉荷亚）进行评估。对值是双尾的，显著性被认为是对< 0.05.
图3。
图3。
RSK2-CREB通路部分通过上调Fascin-1的信号传导促进癌细胞侵袭和肿瘤转移。 A类Fascin-1的稳定敲除可减弱多种转移癌细胞的细胞侵袭。B，FLAG-tagged Fascin-1的表达可通过稳定敲除RSK2，显著挽救各种转移癌细胞中减弱的细胞侵袭潜能。相对侵袭归一化为携带空载体的对照细胞的侵袭。对使用Student的t吨测试。C在M4e异种移植小鼠模型中，Fascin-1的稳定过表达可显著挽救RSK2敲除减弱的淋巴结转移(n个=7，注射M4e细胞的小鼠携带空载体；n个=8，注射RSK2敲除M4e细胞的小鼠；n个=8，小鼠注射M4e细胞，RSK2敲低并过度表达FLAG-Fascin-1）。蛋白质印迹(工作分解结构)结果显示肿瘤裂解物中RSK2的稳定敲除或FLAG-tagged Fascin-1的表达。D类异种移植实验结果表明，M4e细胞中RSK2的敲除导致LN转移显著减少，而Fascin-1的过度表达部分挽救了由于RSK2丢失而降低的转移潜能。淋巴结转移通过H&E染色鉴定(上部面板)和人波形蛋白IHC染色(下部面板).左侧图中显示了各组H&E染色或波形蛋白IHC染色LN的代表性图像。赖特，LN转移是通过计算H&E染色获得的LN总数中转移LN的数量来确定的(顶部).对H&E染色值由Fisher精确检验确定。人类波形蛋白IHC染色结果通过加权指数进行总结(底部).对波形蛋白IHC染色值使用Student’st吨测试。E类RNAi介导的RSK2下调或Fascin-1过度表达并不影响肿瘤大小或肿瘤细胞增殖。在实验终点采集肿瘤并称重，以确定肿瘤形成。单个点代表不同小鼠肿瘤的不同重量(左边). 使用每只小鼠的原发肿瘤样本进行增殖标记蛋白Ki-67的IHC染色(正确的).对使用Student的t吨测试（*，对=0.01–0.05；**，对< 0.01;纳秒，不显著）。
图4。
图4。
RSK2通过CREB→Fascin-1发出信号，促进转移癌细胞中丝状体的形成。A549和SKBR3细胞接种在硅片上，并用SEM进行评估。A类典型的SEM图像显示A549细胞表面形成丝状伪足。RSK2的稳定敲除导致A549细胞表面丝状体数量减少(中间的)与携带空载体的对照A549细胞相比(左边). Fascin-1的过度表达部分挽救了A549细胞中RSK2敲低导致的丝状伪足形成减弱(正确的). 代表性丝状伪足表示为箭头所示。比例尺，2微米。B，从八个随机视野中计算并绘制每个A549细胞系中每个视野中丝状突起的相对平均数。使用Student’st吨测试。C代表性SEM成像结果显示SKBR3细胞表面形成丝状伪足。左侧，用空载体控制SKBR3细胞。中部和正确的，RSK2基因敲除导致SKBR3细胞表面丝状突起数目减少和形态改变(中间的)而Fascin-1的稳定表达可挽救RSK2敲除后丝状伪足形成减少和形态改变(正确的).比例尺，5微米。D类计算并绘制每个SKBR3细胞系中每八个随机场的丝状体尖端相对平均数。使用Student’st吨测试（**，对< 0.01).
图5。
图5。
RSK2需要Fascin-1来促进丝状足类的捆扎。 A类免疫荧光染色结果显示，使用Alexa Fluor 555-conjugated phalloidin对A549细胞中的丝状伪足相关肌动蛋白丝进行染色，可检测到丝状伪满捆绑。稳定的RSK2敲除减少A549细胞中丝状体的捆绑(中间的)与空白载体的对照细胞相比(左边). Fascin-1的过度表达拯救了A549细胞中RSK2敲除减弱的丝状伪足束(正确的).B免疫荧光染色检测SKBR3细胞中丝状伪足束的形成。RSK2基因敲除消除SKBR3细胞中丝状伪足束的形成(中间的)与对照细胞相比(左边). Fascin-1的过度表达部分挽救了SKBR3细胞中RSK2敲除减弱的丝状伪足束的形成(正确的).箭头表明肌动蛋白捆绑与阴茎肽相关。原始放大倍数，1000×。C，Fascin-1的过表达显著挽救了A549、SKBR3和212LN细胞因RSK2的敲低而减少的侵袭，同时用latrunculin A治疗(纬度A)，它破坏肌动蛋白捆绑，消除了Fascin-1过度表达的拯救作用。对使用Student的t吨测试（*，对= 0.01–0.05; **,对< 0.01).
图6。
图6。
RSK抑制剂FMK-MEA可有效减弱多种转移性人类癌细胞的癌细胞侵袭。 A类，用FMK-MEA治疗（6μ米)有效抑制RSK2激酶活性，通过使用特定磷酸化-RSK抗体（p-S380）检测到的RSK2的S386磷酸化水平进行评估，以探测各种转移性人类癌细胞，包括212LN、M4e、A549和SKBR3。B、特定RSK抑制剂对RSK2的抑制，FMK-MEA（6μ米)或SL0101（25μ米)，导致A549细胞的侵袭能力降低，而Fascin-1过度表达可挽救经FMK-MEA或SL0101治疗的细胞侵袭能力降低。相对侵袭性归一化为携带空载体的对照细胞的侵袭性。C，使用FMK-MEA靶向RSK2（6μ米)导致转移性人类癌细胞侵袭性降低在体外基质侵入试验。未经药物治疗的对照细胞的相对侵袭性正常化。D类，用FMK-MEA治疗（6μ米)不降低细胞增殖率。使用增殖检测试剂盒测定细胞数量，并将细胞活力标准化为细胞数量的标准曲线。RSK2活性测定(A类)，入侵检测(B和C)和增殖试验(D类)药物治疗48小时后平行进行。对使用Student的t吨测试(纳秒，不显著；*，对=0.01–0.05；**，对< 0.01).
图7。
图7。
在注射有高转移M4e细胞的异种移植裸鼠中，用RSK抑制剂FMK-MEA治疗可显著降低LN转移，但不降低肿瘤细胞增殖和生长。 A类,左边：显示了经PBS或FMK-MEA处理的M4e异种移植裸鼠LN样品的H&E染色和人波形蛋白IHC染色的代表性图像。赖特，LN转移是通过计算H&E染色获得的LN总数中转移LN的数量来确定的(顶部).对H&E染色值由Fisher精确检验确定。人波形蛋白IHC结果的加权指数表明，与PBS治疗的对照小鼠相比，FMK-MEA治疗显著降低M4e异种移植小鼠的淋巴结转移(底部).对波形蛋白IHC染色值使用Student’st吨测试(n个=10，注射PBS的小鼠；n个=8，注射FMK-MEA的小鼠）。B和C，FMK-MEA靶向RSK2并不影响肿瘤大小或肿瘤内细胞增殖。在实验终点对异种移植物裸鼠的原发性肿瘤进行称重。单个点代表不同小鼠肿瘤的不同重量(B). 使用每只小鼠的原发肿瘤样本进行增殖标记蛋白Ki-67的IHC染色。显示了Ki-67的IHC染色的代表性图像(C).对使用Student的t吨测试。
图8。
图8。
用RSK抑制剂FMK-MEA治疗可显著减弱转移细胞中RSK2-CREB-Fascin-1通路的激活体内. A–C磷酸化-RSK2 Ser-386的IHC染色(A类)，磷酸化CREB Ser-133(B)和Fascin-1(C)使用经PBS或FMK-MEA处理的M4e异种移植裸鼠的LN样品。每组具有代表性的IHC染色图像显示在左边表达以加权指数（WI=阳性染色（%）×强度评分（0～3+））为特征。对值由Student的t吨测试。D类Western blot结果显示，FMK-MEA治疗后，总肿瘤裂解物中RSK2和CREB活性以及Fascin-1表达降低。
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