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.2013年12月；24(23):3710-20.
doi:10.1091/mbc。E13-07-0388。 Epub 2013年9月25日。

αE-catenin肌动蛋白结合域改变肌动蛋白丝构象并调节成核因子和分解因子的结合

斯科特·德汉森 1, 亚当·V·奎亚特科夫斯基, 钟月欧阳, 刘红军, 萨宾·波库塔, 西蒙·沃特金斯, 尼尔斯·沃尔克曼, 多里特·哈因, 威廉·魏斯, R Dyche Mullins公司, W詹姆斯·纳尔逊
附属公司

αE-catenin肌动蛋白结合域改变肌动蛋白丝构象并调节成核因子和分解因子的结合

斯科特·德汉森等。 摩尔生物细胞. 2013年12月.

摘要

肌动蛋白结合蛋白αE-catenin可能有助于细胞迁移和依赖于肌动蛋白细胞骨架重塑的细胞间粘附之间的转换，但其潜在机制尚不清楚。我们发现，αE-连环蛋白肌动蛋白结合域（ABD）与单个肌动蛋白丝协同结合，这种结合伴随着肌动蛋白原聚体的构象变化，从而影响肌动蛋白丝的结构。αE-catenin ABD结合限制了倒钩末端的生长，特别是在肌动蛋白纤维束中。αE-catenin ABD通过Arp2/3复合物抑制肌动蛋白丝分支，并通过cofilin切断，这两种肌动蛋白原体的接触区都被αE-caten ABD结合改变了结构。在上皮细胞中，αE-catenin的分布与发育中的细胞-细胞接触时的Arp2/3复合物之间几乎没有相关性。我们的结果表明，与丝状肌动蛋白结合的αE-catenin有利于未分支的纤维束的组装，而这些纤维束在更具动态的分支纤维阵列上不会被切断。

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图1：
图1：
αE-catenin ABD与肌动蛋白丝协同结合。（A） αE-catenin由五个四螺旋束（蓝色阴影框）和一个C端五螺旋束（红色框）组成。标记了β-连环蛋白/同二聚体区域和肌动蛋白结合域。定义了本研究中使用的所有αE-catenin结构。（B） 1μM GFPαE-catenin ABD与卵磷脂稳定的丝状肌动蛋白结合的定位（20%Cy3标记）。比例尺，5μm。（C） 与单个肌动蛋白丝结合的GFPαE-catenin ABD的平均荧光信号与GFPαE catenin ABD的总浓度成图。每个数据点代表在≥100μm单个肌动蛋白丝（≥2个TIRF流室）上测得的每像素平均GFP荧光。数据拟合为希尔方程（黑色，直线）或双曲线函数（红色，虚线）。（D） Kymography显示在0.5或1μM暗αE-catenin ABD存在或不存在的情况下，2 nM GFPαE-caten ABD与单个肌动蛋白丝侧边结合和解离。（E–G）在没有（E）或存在（F）0.5μM暗αE-catenin ABD或（G）1μM暗βE-cateninABD的情况下，丝状肌动蛋白上2 nM GFPαE-caten ABD停留时间的直方图。插图，1-累积分布频率的曲线拟合：（E）单指数拟合（τ1=70±2毫秒，n个=1244分子），（F）双指数拟合（τ1=88±3毫秒[58%）]，τ2=659±15毫秒[42%]，n个=1289分子），和（G）双指数拟合（τ1=144±4毫秒[64%]，τ2=986±26毫秒[36%]，n个=1210分子）。
图2：
图2：
αE-catenin ABD存在下肌动蛋白丝的冷冻电镜和三维重建。（A） αE-连环蛋白ABD存在下丝状肌动蛋白的代表性电子显微照片。用于重建的节段中心用红色（裸肌动蛋白）和浅蓝色（αE-catenin ABD修饰肌动蛋白（actin））标记。使用无偏差迭代排序程序执行赋值（参见材料和方法). 比例尺，120 nm。（B） 裸露肌动蛋白丝的重建。亚结构域1-4标记在一个肌动蛋白亚基上。左侧显示了长螺距螺旋线上肌动蛋白亚基之间的距离。（C） 用结合的αE-catenin ABD重建肌动蛋白丝。单个αE-catenin ABD的额外密度以蓝色突出显示。比例尺，4 nm。（D） 修饰（C）和裸露（B）肌动蛋白丝重构的重叠（肌动蛋白纤维结构的差异用红色标记）表明，αE-catenin ABD结合诱导肌动蛋白亚结构域2远离纤维中心。比例尺，2 nm。（E） 裸露肌动蛋白丝上装饰丝中额外密度的“足迹”（绿色）显示了αE-catenin ABD的潜在结合表面。比例尺，2 nm。
图3：
图3：
αE-catenin ABD降低丝状肌动蛋白的倒钩末端伸长。（A） 在4μM Mg-ATP-actin（5%Cy3标记）和4μM人profilin 1存在下测得的平均倒刺端聚合速率。与2μM GFPαE-catenin ABD或2μMαE-caten ABD共聚可减缓倒钩端伸长率。GFPαE-catenin ABD与暗αE-caten ABD存在时的单丝伸长率差异表明GFP标签可能会轻微干扰倒钩末端伸长率。误差条，SD(n个来自≥2个实验的≥30个肌动蛋白丝）。（B，C）在4μM Mg-ATP-actin（5%Cy3标记）和4μM人profilin I单独存在下（B）或在2μMαE-catenin ABD（C）存在下延伸的单个肌动蛋白丝的代表性钾谱图。（D） 2μM GFPαE-catenin ABD和KCl浓度增加时的倒刺生长率。请注意，肌动蛋白纤维束的倒刺端伸长对缓冲离子强度的变化不敏感。（E） Kymograph显示了在2μM Mg-ATP-actin、2μM GFPαE-catenin ABD和150 mM KCl存在下，钩端长丝伸长的捆绑依赖性延迟。虚线白线标志着日晷上每根灯丝不断增长的倒刺末端。
图4：
图4：
αE-catenin抑制肌动蛋白丝的Arp2/3复合分支。（A，B）用50 nM Arp2/3络合物和100 nM SCAR聚合的1μM Cy3标记的Mg-ATP-actin的图像VCA公司单独或在GFPαE-catenin ABD（A）或全长GFPαE catenin（B）浓度增加的情况下。在每种情况下，所有蛋白质在TIRF缓冲液中结合，并流入聚乙二醇化成像室以引发聚合。GFPαE-catenin的存在对自发肌动蛋白聚合量没有显著影响。（C） 肌动蛋白丝分支频率的量化。GFPαE-catenin ABD（A）和全长GFPαE-catenin（绿色条）在功能上等同于未标记的αE-caten蛋白（灰色条）。误差条，SD（≥2次实验中丝状肌动蛋白≥200μm）。
图5：
图5：
αE-catenin抑制肌动蛋白细丝的cofilin切断。（A） 在75 nM Atto488-ybbr-hCofilin（绿色）单独或与αE-catenin ABD或全长αE-caten存在的情况下，对ADP肌动蛋白丝（20%Cy3标记，红色）的分解进行蒙太奇。Atto488-ybbr-hCofilin和αE-catenin（ABD和全长蛋白）的混合物同时流入腔室，分别启动切断和肌动蛋白丝结合。（B） cofilin依赖性肌动蛋白丝切断率的量化（断裂μm−1秒−1)αE-catenin ABD的存在与否。误差条，SD（≥2次实验中丝状肌动蛋白≥200μm）。
图6：
图6：
αE-catenin在发育中的细胞-细胞接触中与F-actin共定位。（A，B，E–H）MDCK上皮细胞F-actin、αE-catenin和p34（Arp2/3复合物）染色的3D-SIM图像。比例尺，5μm。（A） 未经提取，αE-catenin分布在整个细胞中，p34沿着前缘富集。C中的黄线标记线扫描。（B）预提取降低了膜突起中的αE-catenin信号，而p34信号被保留。橙色虚线表示单元边界；黄线表示D中的线扫描。（C，D）对照细胞（C；a中的黄线）和预提取细胞（D；B中的黄线上）中细胞外周的F-actin、αE-catenin和p34信号强度的代表性线扫描。预提取去除了细胞外周的大部分αE-catenin信号，而p34信号未受干扰。注意，提取过程中未标记的卵磷脂的存在降低了预提取细胞相对于对照细胞中F-actin信号的强度。（E） 在新生接触中，p34含量丰富，并且存在αE-连环蛋白。橙色虚线标记单元格边界；黄色箭头表示αE-catenin沿触点积聚的区域。（F，G）在4-h（F）和24h（G）细胞-细胞接触时，αE-catenin沿富含F-actin的粘附富集，而p34定位有限。黄色箭头表示电池-电池接触。（H） 预提取后，偶尔沿F-actin束观察到αE-catenin，通常靠近细胞-细胞接触。黄色箭头沿着肌动蛋白束标记αE-catenin点。（一） 皮尔逊的第页沿细胞-细胞接触在单个通道之间进行计算。αE-catenin和p34与F-actin的共定位水平相似；然而，αE-catenin和p34信号之间几乎没有相关性(***第页< 0.0001; 使用Tukey的范围检验进行单向方差分析）。误差条，SEM（35张图像，测量的接触>40个）。
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