RNF115/BCA2 E3 ubiquitin ligase promotes breast cancer cell proliferation through targeting p21Waf1/Cip1 for ubiquitin-mediated degradation

doi:10.1593/neo.13678

.2013年9月；15(9):1028-35.

doi:10.1593/neo.13678。

RNF115/BCA2 E3泛素连接酶通过靶向p21Waf1/Cip1的泛素介导降解促进乳腺癌细胞增殖

王泽华¹, 直聂, 陈文林, 周钟美, 清华港, 阿伦·塞思, 刘荣（音）, 陈切希

附属公司

PMID： 24027428
预防性维修识别码：下午3点769882分
内政部： 10.1593/新13678

RNF115/BCA2 E3泛素连接酶通过靶向p21Waf1/Cip1的泛素介导降解促进乳腺癌细胞增殖

王泽华等人。肿瘤形成. 2013年9月.

.2013年9月；15(9):1028-35.

doi:10.1593/neo.13678。

作者

王泽华¹, 直聂, 陈文林, 周钟美, 清华港, 阿伦·塞思, 刘荣（音）, 陈切希

附属

¹中国科学院和云南省动物模型与人类疾病机制重点实验室，昆明动物研究所，云南昆明。

PMID： 24027428
预防性维修识别码：项目经理3769882
内政部： 10.1593/新13678

摘要

E3泛素连接酶环指蛋白115（RNF115），也称为乳腺癌相关基因2（BCA2），此前有报道称在雌激素受体α（ERα）阳性乳腺肿瘤中过度表达并促进乳腺细胞增殖；然而，其机制尚不清楚。在本研究中，我们证明了在两个ERα阳性乳腺癌细胞系MCF-7和T47D中，通过小干扰RNA（siRNAs）沉默BCA2可降低细胞增殖并增加细胞周期素依赖性激酶抑制剂p21Waf/Cip1的蛋白水平。p21的蛋白质稳定性受BCA2负调控。BCA2直接与p21相互作用，促进p21泛素化和蛋白酶体降解。敲除p21可部分缓解BCA2 siRNA诱导的细胞生长停滞。这些结果表明，BCA2至少部分通过下调p21的表达促进ERα阳性乳腺癌细胞的增殖。

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数字

图1
BCA2基因敲除抑制乳腺癌细胞增殖、DNA合成和细胞周期。（A） WB分析永生化乳腺上皮细胞系和ERα阴性和ERα阳性乳腺癌细胞系中BCA2蛋白水平。GAPDH被用作负荷控制。（B）用Lipofectamine 2000试剂作为模拟、对照siLuc RNA、siBCA2-A#或siBCA2-B#转染MCF-7和T47D细胞72小时。通过WB分析评估敲除效果，并使用SRB分析检测细胞活力(***P（P）*与siLuc相比<.01）。（C）在siBCA2-A#沉默BCA2后，用EdU Alexa Fluor 647脉冲标记MCF-7和T47D细胞4小时，并用10µg/ml PI。与EdU合并的阳性细胞百分比显示在直方图中（右侧***P（P）*< .01). 所有定量值均来自三次重复实验。（D）在siBCA2-A#沉默BCA2后，取MCF-7和T47D细胞，固定，PI溶液染色，流式细胞仪分析。被捕百分比G₁直方图中显示了时相细胞(**P（P）*<0.05和***P（P）*< .01).

图2
BCA2缺失在蛋白质水平上调p21的表达，但在mRNA水平上不上调。（A）用siLuc或siBCA2转染MCF-7和T47D细胞72小时。通过WB分析分析BCA2、p21、p27和p53的蛋白水平。（B） mRNA水平*BCA2，第21页，第27页*、和*第53页*采用半定量RT-PCR进行分析。*GAPDH公司*用作加载控件。

图3
（A） BCA2通过蛋白酶体促进p21蛋白降解。如图所示，将标记-BCA2和HA-p21共转染到HEK293FT细胞中。蛋白酶体抑制剂MG132（10µM）如有必要，加入该药物治疗细胞8小时。（B）在MCF-7细胞中用siBCA2-A#耗尽BCA2后，将细胞暴露于CHX中一段时间，并进行WB分析。右侧显示了来自两个独立实验的p21蛋白的定量半衰期。（C） HEK293FT细胞与HA-p21和WT BCA2或环指突变BCA2表达质粒共转染。BCA2-RINGm蛋白的迁移速度比WT-BCA2慢得多，可能是因为在电泳条件下蛋白质结构的差异。细胞暴露于CHX一段时间，如图所示。WB分析检测p21蛋白水平。右侧显示了两个独立实验的定量数据。

图4
BCA2与p21相互作用并促进其泛素化。（A） HA-p21表达结构分别与空白对照或Flag-BCA2表达质粒瞬时共转染到HEK293FT细胞中。培养48小时后，细胞暴露于10µM MG132放置4小时，并使用抗Flag M2亲和凝胶收集用于免疫沉淀实验。使用抗Flag和抗HA抗体对样本进行WB分析。总细胞裂解物用作输入对照。（B）用抗p21抗体或兔IgG对照免疫沉淀来自指数生长的MCF-7细胞的细胞裂解物。用抗p21和抗BCA2抗体对沉淀进行WB分析。（C） HA-p21表达结构分别与pEBG载体作为对照，pEBG-BCA2作为阳性对照，或截短的GST-BCA2表达质粒在HEK293FT细胞中瞬时共转染。48小时后收集总的细胞裂解物，并用谷胱甘肽Sepharose 4B沉淀。使用抗HA和抗GST抗体对沉淀蛋白进行WB分析。总细胞裂解物用作输入对照。（D）如图所示，HEK293FT细胞与一组表达质粒瞬时共转染。48小时后，用10µM MG132并裂解。样品在变性条件下用Ni-NTA琼脂糖珠沉淀。用抗HA和抗Flag抗体对蛋白质进行WB分析。

图5
BCA2通过下调p21的表达部分促进乳腺癌细胞增殖。如图所示，用siLuc、sip21和siBCA2 siRNA瞬时转染MCF-7和T47D细胞。72小时后收集细胞裂解物并进行WB分析。显示了MCF-7（A）或T47D（B）中p21和BCA2的蛋白质水平。通过SRB测定法测量细胞活力，并分别显示在图中，（A）MCF-7或（B）T47D(***P（P）*< .01).

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