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.2013年9月3:2:e00726。
doi:10.7554/eLife.00726。

DNA甲基化为人类转录因子提供了不同的结合位点

胡少辉 1, Jun Wan先生, 苏一静, 宋奇峰, 曾亚雪, 下南阮, Jaehoon Shin先生, 埃里克·考克斯, 希·索尔·罗, Crystal Woodard公司, 夏淑丽, 刘爽（音译）, 吕惠宾, 郭立明, 赫谢尔·韦德, 宋红军, 姜倩, 朱恒
附属公司

DNA甲基化为人类转录因子提供了不同的结合位点

胡少辉等。 埃利夫. .

摘要

DNA甲基化，特别是启动子区的CpG甲基化，通常被认为是一种有效的表观遗传修饰，可以阻止转录因子（TF）的募集，从而导致转录抑制。在这里，我们使用基于蛋白质微阵列的方法系统地调查了整个人类TF家族，发现许多纯化的TF具有甲基化CpG（mCpG）依赖的DNA结合活性。有趣的是，一些TF对不同序列的甲基化和非甲基化DNA基序表现出特定的结合活性。为了阐明其潜在机制，我们将重点放在克鲁珀样因子4（KLF4）上，并通过定点突变使其mCpG和CpG结合活性解耦。此外，KLF4结合体内人类胚胎干细胞中特定的甲基化或非甲基化基序。我们的研究表明，mCpG依赖性TF结合活性是一种普遍存在的现象，并为理解TF在基因转录的表观遗传调控中的作用和机制提供了一个新的框架。内政部：http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00726.001。

关键词：DNA甲基化；人类；表观遗传学；蛋白质芯片；蛋白质-DNA相互作用；转录因子；转录调控。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1。
图1.基于蛋白质微阵列的方法确定了人类TF和辅因子中依赖mCpG的DNA结合活性。
(A类)竞争分析用于鉴定优先与甲基化DNA基序结合的蛋白质。SCAPER（ER中的S期细胞周期蛋白A相关蛋白）和E2F3（E2F转录因子3）是甲基化DNA结合蛋白的两个例子。(B类)使用已知甲基化DNA结合蛋白在先导蛋白微阵列上进行了原理验证。(C类)在相互作用图中总结了41个TF和6个辅因子与154个测试甲基化DNA基序中的150个的结合谱。TF基于子家族进行颜色编码。(D类)EMSA分析验证了四个选定TF候选物的DNA结合活性。显示了三个独立实验的代表性图像，结果相似。(E类)竞争性EMSA测定证实了mCpG依赖性DNA结合活性。正如预期的那样，10倍的未标记甲基化DNA基序很容易消除测试TF与生物素化和甲基化DNA模序形成的蛋白质-DNA复合物（每张图片中的第1道）。然而，10倍的冷非甲基化DNA对应物无法竞争甲基化DNA结合，这与蛋白质微阵列结果一致。(F类)HOXA5和DIDO1显示GT1-7细胞中荧光素酶活性的mCpG依赖性激活。数值代表平均值±SD（n=3；**:p<0.01；t吨-测试）。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00726.003
图1——图补充1。
图1-图补充1。蛋白质微阵列分析的数据分析。
(A类)数据规范化工作流程。(B类)局部归一化（窗口大小9×9）。(C类)背景噪声分布外推。噪声分布N个2从N个1.根据分布计算标准偏差（SD）N个（下面板）。(D类)微阵列上所有蛋白质的Z分数分布。在我们的研究中，选择Z=3作为临界值，以确定阳性结果。先前确定的一些甲基化DNA-结合蛋白的Z分数低于我们的临界值（Spruijt等人，2013），而KLF4的一个DNA基序的Z分数大于6。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00726.004
图1—图补充2。
图1补充图2。蛋白质微阵列数据的再现性。
左图：与基序M303的重复结合测定之间的信号比较显示出高度相关性，证实了测定的再现性。右侧面板：两种随机结合分析之间的比较显示，基序M303和M259之间无相关性。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00726.005
图1——图补充3。
图1-图补充3。在给定的基序结合分析中，mCpG-结合TFs/辅因子的数量分布。
TFs/辅因子与一个甲基化CpG基序结合的中值为8。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00726.006
图1——图补充4。
图1-图补充4。由给定TF/辅因子识别的甲基化基序的数量分布。
大多数TFs/辅因子与极少数甲基化DNA基序结合；而在本研究测试的154个基序中，有7个TF与77个以上的基序结合。内政部： 网址：http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00726.007
图1——补充图5。
图1-图补充5.特遣队亚家族成员的分布。
(A类)显示mCpG结合活性的TF亚家族成员的分布。(B类)TF蛋白微阵列上显示的所有注释TF亚家族成员的分布。统计分析表明，没有一个TF亚家族的甲基化基序结合活性显著增强（p<0.01）。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00726.008
图1——图补充6。
图1补充图6。另外四种EMSA分析（A）和竞争EMSA分析。
结果证实了mCpG依赖的DNA结合活性的特异性。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00726.009
图1——图补充7。
图1补充图7。KLF4和HOXA5荧光素酶报告子构建物的甲基化水平。
将KLF4（TCCCGCCCA）和HOXA5（AAACGCTGCC）结合基序的8个单元分别克隆到无CpG荧光素酶报告载体的启动子区，并用甲基化的方法将其甲基化新加坡证券交易所I转染GT1-7细胞之前。亚硫酸氢盐测序证实，两个基序的CpG甲基化水平在新加坡证券交易所I治疗。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00726.010
图1-补充图8。
图1-图补充8.在测试的甲基化DNA基序数量的功能中独特的mCpG结合TFs/共因子的数量。
曲线远未达到饱和，这表明还有更多此类TF/协同因子有待发现。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00726.011
图2。
图2.一组17个TF可以结合不同序列的甲基化和非甲基化基序。
(A类)我们之前的PDI数据集与本研究中的数据集一起编译，以生成17个TF的绑定偏好。基于蛋白质微阵列结果鉴定的17个TF的甲基化共有基序与其已知共有基模进行了比较。(B类)EMSA分析证实，四种TF可与不同序列的甲基化和非甲基化基序特异性相互作用。显示了三个独立实验的代表性图像，结果相似。(C类)和(D类)提出了两种可能的方案来区分这些TF及其对应基序之间的相互作用模式。(E类)和(F类)竞争EMSA分析表明，这两种情况都是可能的。每个面板中显示了两个独立实验的代表性图像，结果相似。(G公司)ZMYM3和KLF4分别与甲基化基序M203和M197及其非甲基化对应物结合的OIRD传感图。在每种蛋白质的两种浓度下进行OIRD测量。实线表示OIRD信号。虚线安装在On和Off曲线上。红色箭头表示将TF蛋白引入OIRD反应室的起点。蓝色箭头表示添加清洗缓冲液的时间点。(H（H）)平均值汇总K（K）D类在每种蛋白质的两种浓度下测得的值。”NB'表示没有观察到结合信号。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00726.012
图2——图补充1。
图2-图补充1。ARID3B和ZMYM3的竞争EMSA分析。
正如预期的那样，未标记和甲基化基序M319与标记的甲基化基模M319表现出剂量依赖性竞争；而未标记和未甲基化的基序M47可以很容易地竞争结合信号。ZMYM3也观察到相同的结果。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00726.013
图2——图补充2。
图2-图补充2：KLF4和TFAP2A的竞争EMSA分析。
KLF4与甲基化mM197之间以及KLF4和非甲基化umM412之间的复合物形成分别不受umM411或mM917的影响。然而，当同时添加甲基化和非甲基化竞争物DNA时，复合物的形成被取消。内政部： 网址：http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00726.014
图2——补充图3。
图2-图补充3。KLF4的双重特异性总结。
竞争EMSA分析证实KLF4对甲基化基序M197（mM197）和非甲基化基模M412（umM412）的结合特异性。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00726.015
图2——图补充4。
图2补充了图4。三种TF和MBD2b与三种甲基化DNA基序结合的OIRD感测图。
(A类)已报告的MBD2bK（K）D类在OIRD系统中使用330nM的值作为基准，显示MBD2b与甲基化M203、M213和M197结合的传感图。(B类)–(D类)ZMYM3、TFAP2A和KLF4与甲基化基序M203、M213和M197及其非甲基化对应物结合的OIRD感测图。在每种蛋白质的两种浓度下进行OIRD测量。实线表示OIRD信号。虚线安装在On和Off曲线上。红色箭头表示将TF蛋白引入OIRD反应室的起点。蓝色箭头表示添加清洗缓冲液的时间点。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00726.016
图3。
图3.KLF4的mCpG依赖性结合活性与其结合活性与非甲基化基序解耦。
(A类)KLF4–DNA相互作用的模拟预测，Arg458和Asp460这两个残基参与了与甲基化胞嘧啶的相互作用。双箭头表示Arg458和单链胞嘧啶甲基之间的范德瓦尔斯相互作用（5mCA类). 红色的球代表水分子。(B类)Asp460进一步稳定了另一股（5mC）上5 mC的结合B类)通过CH•••O（H2O-5mC）氢键触点。(C类)使用KLF4突变蛋白的EMSA分析表明，R458和D460对mCpG依赖性结合活性至关重要。显示了三个独立实验的代表性图像，结果相似。(D类)在M197的基于细胞的荧光素酶分析中，WT KLF4显示下游基因表达的mCpG依赖性激活（上部面板中的红色条），而R458A和D460A突变都取消了该活性（中部和下部面板中的红条）。(E类)在使用M412（蓝条）进行的基于细胞的荧光素酶分析中，WT和突变体都可以激活非甲基化M412的表达（蓝条。在(D类)和(E类)，值表示平均值±标准差（n=3；**:p<0.01；t吨-测试）内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00726.017
图3——图补充1。
图3-图补充1.KLF4 DNA-结合域的结构。
KLF4在其C末端编码两个半锌指DNA结合域。预计与胞嘧啶中5-甲基相互作用的残基R458和D460位于zf-H2C2结构域。D432指示截断的KLF4构造的结束位置。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00726.018
图3——图补充2。
图3补充2。MeCP2和ZFP57与甲基化DNA复合物的已知晶体结构。
粉红色和蓝色双箭头表示精氨酸和甲基之间的范德瓦尔斯力。红球是水分子。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00726.019
图3——补充图3。
图3补充图3。EMSA分析评估KLF4 R458K、R458A:：D460A突变和Δ432截断对其与基序M412和M197结合活性的影响。
这些结果清楚地表明，无论是单突变还是双突变，还是截短突变，都破坏了KLF4与甲基化基序M197形成复合物的能力，而两者均未对与非甲基化基模M412形成复合物产生可检测的影响。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00726.020
图3——图补充4。
图3图补充4 KLF4过度表达的Western blot分析重量、KLF4R458安和KLF4D460安GT1-7细胞中的蛋白质。
以GAPDH为对照，这些结果表明构建物的转染效率相同。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00726.021
图4。
图4内源性KLF4与体内人类胚胎干细胞（H1）中的甲基化位点结合。
(A类)生物信息学分析，通过整合H1细胞中的KLF4 ChIP Seq和甲基组数据，得出与KLF4结合的甲基化DNA基序标志。根据KLF4结合位点甲基化水平的分布，在高甲基化位点中发现了一个顶部甲基化的共识基序，用红色框起来。作为比较，KLF4在蛋白质微阵列分析中识别的M197序列如下所示。(B类)KLF4 ChIP-二亚硫酸盐测序的实验程序，以确认KLF4优先与H1细胞中的高甲基基序相互作用。(C类)KLF4 ChIP’ed基因座的凝胶图像（L1:chr1:559311-559516；L2:chr5:44424678-44424792；L3:chr16:4681299-4681481；L4:chr2:132747088-132747377；L5:chr12:81828301-81828506）证明了KLF4与其靶区的特异性和直接结合。在没有抗KLF4单克隆抗体的情况下进行阴性对照。(D类)用定量实时PCR（qPCR）方法分析KLF4-ChIP对五个基因座的影响。通过KLF4-ChIP qPCR信号与阴性对照信号的比值，获得每个位点的折叠变化。统计分析基于三次技术复制。(E类)桑格亚硫酸氢盐测序读取输入和KLF4-ChIP’ed DNA。填充圆圈和空白圆圈分别表示甲基化和非甲基化CpG位点。蓝色和红色箭头分别表示图案M412和M917中的CpG。(F类)对于相对较低的甲基化输入，KLF4甲基化结合位点往往在KLF4 ChIP之后具有较高的甲基化水平。中的下部面板(F类)显示了输入DNA和KLF4 ChIP'ed DNA之间每个CpG位点的甲基化差异。p值由二项式概率密度函数确定。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00726.022
图4-图补充1。
图4补充1。H1细胞中KLF4 ChIP-seq和甲基体数据的整合。
编译H1中的KLF4 ChIP-Seq和甲基组数据，以指定KLF4 ChIP'ed片段的甲基化水平（上面板）。下面板是KLF4结合峰的示意图。粉红色椭圆表示KLF4 ChIP-seq实验中确定的KLF4结合峰。红色和蓝色的短垂直线分别表示基序M197和M421上下文中的CpG位点。其他CpG站点用灰色线条标注。下面的细绿线代表观察到的甲基化水平。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00726.023
图4——图补充2。
图4补充2。五个选定的KLF4-结合位点用于进一步分析。
显示了染色体位置和KLF4 ChIP-seq峰（GSM447584）。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00726.024
图4——补充图3。
图4补充图3。KLF4 ChIP-二亚硫酸盐测序分析示例。
测序结果证实KLF4在H1细胞CCmCGCC（箭头）序列上下文中与超甲基化位点结合。上图和下图表示输入和KLF4 ChIP’ed基因座的亚硫酸氢盐测序结果。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00726.025
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中的注释

  • 充分利用甲基化。
    Vermeulen M。 Vermeulen M。 埃利夫。2013年9月3日；2:e01387。doi:10.7554/eLife.01387。 埃利夫。2013. PMID：24015362 免费PMC文章。

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