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.2014年2月；21（2）：247-57。
doi:10.1038/cdd.2013.123。 Epub 2013年9月6日。

EMT激活剂ZEB1促进肿瘤生长并确定套细胞淋巴瘤对化疗的不同反应

E Sánchez-Tilló 1, L Fanlo公司 2, L塞尔斯 1, 蒙特斯·莫雷诺 三, 摩洛人 4, G奇瓦·布兰奇 5, R Estruch公司 5, 马丁内兹 6, D彩色 4, B Győrfy公司 7, G Roué 4, 波斯蒂戈 8
附属公司

EMT激活剂ZEB1促进肿瘤生长并确定套细胞淋巴瘤对化疗的不同反应

E Sánchez-Tilló等。 细胞死亡差异. 2014年2月.

摘要

套细胞淋巴瘤（MCL）是一种B细胞恶性肿瘤，其特点是治疗和预后不良。MCL亚群中不同信号通路的组成性激活，通过遗传和/或非遗传改变，使肿瘤细胞增殖增强，凋亡减少。典型的Wnt通路（β-catenin/TCF-LEF）与许多癌症的发病机制有关，在半数MCL中具有组成性活性。这里，我们发现ZEB1是一种已知的促进肿瘤转移的转录因子，在具有活性Wnt信号的原代MCL中表达。MCL细胞中ZEB1的表达依赖于Wnt，受β-catenin敲低或盐霉素阻断Wnt信号传导的下调。敲除ZEB1会降低MCL细胞的体外细胞活力和增殖，重要的是，会降低小鼠异种移植模型中的肿瘤生长。ZEB1激活增殖相关基因（HMGB2、UHRF1、CENPF、MYC、MKI67和CCND1）和抗凋亡基因（MCL1、BCL2和BIRC5），并抑制促凋亡基因（TP53、BBC3、PMAIP1和BAX）。我们发现，MCL细胞中ZEB1的表达决定了对化疗药物的不同耐药性，并调节了参与药物流入/流出的转运蛋白。盐霉素下调ZEB1可增加MCL细胞对阿霉素、阿糖胞苷和吉西他滨的细胞毒性作用的敏感性。最后，盐霉素和阿霉素在已建立和原代MCL细胞中表现出协同作用。这些结果确定MCL中的ZEB1促进细胞增殖、增强肿瘤生长和对化疗药物的不同反应。因此，ZEB1可能成为该淋巴瘤的预测性生物标志物和治疗靶点。

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数字

图1
图1
ZEB1在MCL中表达，并与β-连环蛋白。代表性MCL样品染色阳性和阴性β-连环蛋白。用免疫组织化学方法检测MCL TMA石蜡包埋切片β-如补充信息中所述，catenin（C2206，克隆14的结果相同）或ZEB1（Zfhep，H-102的结果相同。放大倍数，×400。(b条)ZEB1表达越高，预后越差。Blenk基因芯片MCL患者的Kaplan-Meier生存图等。根据他们的表达水平。ZEB1表达最高的患者（截止值：上四分位数，红线）的生存期比ZEB1表达较低的患者（第二、第三和第四四分位数，绿线）的生存期短。n个=63，危险率=5.3，P（P）=7.7 × 10−7. (c（c）)如中所示b条，但使用Rosenwald的基因微阵列数据集等。 n个=64，危害率=2.38；P（P）=0.0075
图2
图2
ZEB1由MCL细胞中的Wnt信号诱导。(一)Wnt信号的激活上调ZEB1。将Granta-519和Jeko-1细胞与10 ng/ml LMB或相同体积量的LMB溶剂（70%甲醇，MeOH）孵育1 h。评估细胞裂解物的ZEB1（H-102），β-catenin（克隆14）和α-微管蛋白（B5-1-2）。(b条)如中所示一，但细胞用50%（v/v）的L细胞对照培养基和L细胞Wnt3a调节培养基（分别为Ctl-cm和Wnt3a-cm）培养24小时。(c（c）)MCL细胞中ZEB1 mRNA的表达取决于β-连环蛋白。Granta-519和Jeko-1 MCL细胞被ZEB1（shZEB1）或β-连环蛋白βcat）或转染shRNA对照（shCtl）检测ZEB1和β-通过qRT-PCR测定GAPDH相关的catenin mRNA水平。Mann–Whitney评估了统计显著性U型-测试：**P（P）<0.01和***P（P）<0.001. (d日)如中所示c（c），但通过ZEB1（H-102）和α-微管蛋白（B5-1-2）作为负荷控制
图3
图3
盐霉素抑制ZEB1表达。(一)感染shCtl或shZEB1的Granta-519和Jeko-1 MCL细胞用5μM（M）盐霉素48小时或等量的其溶剂（甲醇、MeOH）。对裂解液进行ZEB1（H-102）和β-catenin（克隆14）使用α-微管蛋白（B5-1-2）作为负荷控制。(b条)盐霉素抑制ZEB1 mRNA的表达。如中所示一，但评估相对ZEB1和β-通过qRT-PCR对GAPDH进行连环蛋白mRNA检测。统计显著性由吨-测试：***P（P）<1 × 10−5. (c（c）)盐霉素抑制β-连环蛋白和TCF4在ZEB1启动子的−578和−161 bp处连接到TCF-LEF位点。用MeOH或5处理Granta-519细胞48小时后，ChIP分析中ZEB1和GAPDH启动子免疫沉淀片段的qRT-PCR扩增μM（M）盐霉素。缺少TCF-LEF位点的GAPDH启动子被纳入阴性对照。来自ChIP的GAPDH启动子的qRT-PCR带有针对RNA Pol II的抗体，作为阳性对照。值表示相对绑定对输入。Mann–Whitney评估了统计显著性U型-测试：*P（P）<0.05; ***P（P）<0.001; NS，不显著，P（P）>0.05. (d日)盐霉素抑制TCF/LEF介导的ZEB1转录。293T细胞暴露于5μM（M）盐霉素转染0.5μg人ZEB1启动子荧光素酶报告子野生型或TCF/LEF结合位点突变为−161和−578 bp。相对荧光素酶单位（RLU）的测定如材料和方法所述。统计显著性由吨-测试如下：*P（P）<1 × 10−3; ***P（P）<1 × 10−5; NS、，P（P）>1 × 10−3
图4
图4
ZEB1促进MCL细胞的活性和增殖。(一)ZEB1敲除Granta-519细胞和Jeko-1 MCL细胞，β-通过MTT分析评估catenin或感染对照shRNA的细胞活性。值是相对于shCtl单元格表示的。Mann–Whitney评估了统计显著性U型-用测试***P（P）<0.001. (b条)敲除ZEB1可降低MCL细胞增殖。如中所示一，Granta-519 MCL细胞因ZEB1或β-对catenin或感染对照shRNA的患者进行评估三H-胸腺嘧啶掺入。统计显著性由吨-使用以下键进行测试：***P（P）<1×10−5. (c（c）)如中所示b条但通过BrdU掺入评估细胞增殖。Mann–Whitney评估了统计显著性U型-使用测试***P（P）<0.001. (d日)ZEB1正向调节增殖相关基因。ZEB1敲除下调增殖相关基因的表达HMGB2、UHRF1、CENPF，MYC，MKI67/Ki-67型和CCND1/细胞周期蛋白D1用shCtl或shZEB1干扰MCL细胞，并通过qRT-PCR评估mRNA水平。ND，不可检测的HMGB2型在Jeko-1细胞中。统计显著性由吨-使用以下键进行测试：***P（P）<1 × 10−5, **P（P）<1 × 10−4. (e（电子）)敲除MCL细胞中ZEB1上调凋亡前基因(TP53、BBC3/Puma、PMAIP1/Noxa、，和行李)下调抗凋亡药物(MCL1、BCL2、，和BIRC5/Survivin公司). 通过qRT-PCR评估shCtl或shZEB1干扰的MCL细胞指示基因的相对mRNA表达。shZEB1细胞中相对mRNA水平相对于shCtl细胞表达。ND，在Jeko-1细胞中未检测到p53的表达。ZEB1（shZEB1）敲除MCL细胞中每个基因表达的统计意义对那些干扰shCtl的人由Mann–Whitney进行评估U型-使用以下键进行测试：**P（P）<0.01, ***P（P）<0.001
图5
图5
ZEB1调节MCL细胞中药物转运蛋白的表达。(一)ZEB1调节MCL细胞中外排药物转运蛋白的表达。对shCtl或shZEB1干扰的MCL细胞进行外排转运体相对mRNA的评估MDR1型，物料需求计划1，MRP2型，墨西哥比索和MRP5型通过qRT-PCR。统计显著性一和b条由Mann–Whitney进行评估U型-使用以下键进行测试：*P（P）<0.05; ***P（P）<0.001; NS，不显著，P（P）>0.05. ND，不可检测水平。(b条)如中所示一但对于内流药物转运蛋白ENT1和CNT1。(c（c）)如图1a所示，Wnt的MCL激活或非激活的典型案例，定义为β-catenin对MRP1（QCRL-1）、MXR（B-25）和CNT1（H-70）进行免疫染色。放大×200。ZEB1和这些药物转运蛋白之间相关性的统计显著性如表2所示
图6
图6
ZEB1决定MCL对化疗药物的不同反应，MCL受盐霉素调节。(一)MTT法评估shCtl或shZEB1干扰的Granta-519 MCL细胞对阿霉素、长春新碱、阿糖胞苷或吉西他滨的剂量反应。药物存在时的数值被标准化为未经治疗的情况。面板中的统计显著性一，b条和c（c）由一对吨-测试。(b条)阿霉素降低肿瘤生长，在ZEB1基因敲除后进一步下降。在CB17-SCID小鼠皮下注射Granta-519 shCtl或Granta-5129 shZEB1细胞。然后用1.25 mg/kg阿霉素或载药溶剂（PBS）每周给小鼠治疗两次，并在指定的时间点测量肿瘤体积。Mann–Whitney评估了统计显著性U型-使用测试**P（P）<0.01. (c（c）)盐霉素增加MCL细胞对化疗药物的敏感性。Granta-519 MCL细胞在48小时内接受盐霉素（1）亚最佳剂量（MTT杀死80%的细胞，见图6a和补充图S4aμM（M）)和阿霉素（50 nM（M）)、阿糖胞苷（250μg/ml）或吉西他滨（5μg/ml）。(d日)盐霉素与阿霉素在已建立的MCL细胞系中协同发挥细胞毒性作用。Granta-519 MCL细胞在48小时内暴露于盐霉素和阿霉素的不同组合。在面板中d日和e（电子），通过补充材料和材料与方法中所述的Chou–Talalay CI方法评估两种药物之间是否存在协同作用。CI值低于1.0表示协同作用。各剂量盐霉素联合阿霉素（10n）的统计学意义M（M），25牛顿M（M）或50 nM（M）)Mann-Whitney对不含阿霉素的相同剂量进行了评估U型-使用以下键进行测试：*P（P）<0.05; **P（P）<0.01; ***P（P）<0.001; NS，不显著，P（P）>0.05. (e（电子）)如中所示d日，但使用三名患者的原代MCL细胞。注意，原代MCL细胞中的剂量与已建立的细胞系中使用的剂量不同
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