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.2014年1月；1838年（第1部分B）：300-9。
doi:10.1016/j.bbamem.2013.08.008。 Epub 2013年8月28日。

新城疫病毒进入宿主细胞：酸性pH值和内吞作用

洛伦娜·桑切斯·菲利佩 1, 恩里克·维拉尔, 伊莎贝尔·穆尼奥斯·巴罗佐
附属公司

新城疫病毒进入宿主细胞：酸性pH值和内吞作用

洛伦娜·桑切斯·菲利佩等。 Biochim生物物理学报. 2014年1月.

摘要

大多数副粘病毒通过病毒包膜与质膜的直接融合进入细胞。我们以前的研究表明，新城疫病毒（NDV）与早期内体标记物EEA1共定位，小窝蛋白磷酸化药物佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（PMA）对NDV融合的抑制促使我们提出NDV通过内吞作用进入细胞。在这里，我们发现在HeLa和ELL-0细胞中短暂暴露于低pH后，NDV-F促进的病毒-细胞融合和细胞-细胞融合增加了约30%，但在NDV受体缺乏的细胞系如GM95或Lec1中没有。在短暂的低氢暴露后，29°C下NDV融合的百分比与37°C下未经酸性pH刺激的NDV融合百分比相似，这意味着酸性pH会降低能量屏障以增强融合。此外，用蛋白激酶C抑制剂双吲哚甲酰胺对细胞进行预孵育，可抑制约30%的NDV感染性，表明病毒群体通过受体介导的内吞作用进入细胞。此外，GTPase dynamin在NDV进入中的参与表现为其特异性抑制剂dynasore，也损害了NDV融合和感染性。抑制内体酸化的药物，如连接霉素A、莫能菌素和氯喹，显著影响宿主细胞的最佳感染。这些结果支持了我们的假设，即NDV通过质膜以及动力蛋白-低pH值-和受体依赖性内吞作用进入ELL-0和HeLa细胞。

关键词：BIM；细胞内吞；低pH值；NDV；副粘病毒；R18；红细胞；病毒进入；双吲哚甲酰胺；莫伊；感染的多样性；十八烷基罗丹明B氯化物；红细胞。

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数字

无
图形摘要
图1
图1
酸性pH值对NDV与不同细胞株融合的影响。R18-细胞复合体在pH 7.4或pH 5.0的缓冲PBS下37°C下暴露3分钟脉冲。在37°C、常规培养基和中性pH下培养1小时后，通过将R18红色染料转移到细胞膜上来评估融合，并按照材料和方法中的详细说明进行量化。（A） 代表性实验的显微照片。（B） 数据是三个独立实验的平均值±SD。使用配对数据进行统计分析t吨测试：***，p<0.001，极显著。
图2
图2
在酸性pH下增强NDV F促进的细胞-细胞融合。（A）HeLa和ELL-0细胞单层在37°C下感染1 moi NDV 1h。然后，用pH 5.0或pH 7.4缓冲PBS的三个脉冲（每个脉冲3分钟）处理细胞，每个脉冲之间间隔1小时。感染后7小时，用乙酰胰蛋白酶消化激活病毒F蛋白，感染后24小时，用Giemsa对合胞体进行染色，并使用Adobe Photoshop程序对现场占用区域进行量化，详见材料和方法。（B） 用HN-和/或F-质粒转染HeLa细胞，用乙酰胰蛋白酶激活F0前体，然后立即用pH5.0或pH7.4缓冲PBS的三个脉冲处理细胞，如（A）所示。转染后48小时，细胞固定并用结晶紫染色，以进行合胞体定量，如（A）所示。对照，模拟转染细胞。数据为三个独立实验的平均值±标准差。**，p<0.01，具有高度统计意义；***，p<0.001，极显著。
图3
图3
酸性pH对新冠病毒感染性的影响。将rNDV-F3aa-mRFP在室温下以10 moi感染不同细胞系的单层细胞（HeLa细胞除外，moi为1）1 h。然后，用pH 5.0或pH 7.4缓冲PBS的三个脉冲（每个脉冲3分钟）处理细胞，每个脉冲之间间隔1小时。感染后24小时，通过计算红荧光细胞（感染细胞）占三个随机域中细胞总数的百分比，分析感染性。（A） 代表性实验的显微照片。（B） 数据是三个独立实验的平均值±SD。**，p<0.01，具有高度统计意义；***，p<0.001，极显著。
图4
图4
酸性pH值对NDV F促进细胞-细胞融合的温度依赖性的影响。RBC为双NDV载体。转染后24小时，用乙酰胰蛋白酶激活F0前体，并用pH 5.0或pH 7.4缓冲PBS在37°C下处理细胞5分钟。然后，将细胞与标记的RBC（0.2%红细胞压积）在不同温度下培养1h。清洗未结合的红细胞后，分析染料转移的程度，并将其量化为红（R18）或绿（钙黄绿素）染色细胞占细胞总数的百分比。显示了有关R18转移的数据，这些数据与钙调素转移的数据类似（未显示）。（A） 代表性实验的显微照片。（B） 结果是三个独立实验的平均值±SD。使用配对数据进行统计分析t吨检验：*p<0.05，具有统计学意义：**p<0.01，非常显著。
图5
图5
PKC抑制对NDV感染性的影响。在感染性实验的不同时间，用PKC抑制剂BIM处理细胞单层。在室温下用rNDV-F3aa-mRFP以10的moi（对于HeLa细胞为1个moi）感染细胞1小时，并在感染后24小时通过计算六个随机场中红色荧光细胞（感染细胞）占细胞总数的百分比来分析感染性。对照组，不含药物的细胞；病毒+BIM：细胞在药物存在下被感染，感染后药物被撤回；病毒+BIM/BIM：细胞在药物存在的情况下受到感染，该药物在检测期间也存在；病毒/BIM：感染未经处理的细胞，并在感染后1小时添加药物；BIM：存在药物的非感染细胞。（A） 代表性实验的显微照片。（B） 数据为三个独立实验的平均值±标准差。**，p<0.01，具有高度统计意义；***，p<0.001，极显著。
图6
图6
动力学抑制对NDV活性的影响。（A） 对NDV融合的影响。HeLa和ELL-0细胞之前在37°C条件下，在dynasoir存在下培养30分钟。然后，将2μg R18-NDV在4°C下与细胞结合30分钟，然后在37°C下在药物的持续存在下融合1小时。材料和方法中详细描述了融合的量化，即红染色细胞占总细胞的百分比。（B） 对NDV感染性的影响。HeLa和ELL-0细胞之前在37°C下在dynasore存在下培养30分钟，然后在37°C下在含有rNDV-F3aa-mRFP抑制剂的情况下感染1小时，moi为0.1（HeLa）或1（ELL-0），以提供未经处理的对照细胞中约50%的感染细胞。Dynasore在培养基中再存在2小时，然后清洗和培养24小时。传染性的量化如图3中的图例所示。（C） 用80μM的达纳沙星处理细胞后，细胞以1的moi感染NDV“Clone 30”。感染后24小时，通过基于FACS的免疫分析分析感染性，详见材料和方法。数据是G平均荧光值占对照组未处理和感染细胞的百分数，取100%。（D） 添加dynasore的时间对NDV感染性的影响。用rNDV-F3aa-mRFP感染细胞（HeLa和ELL-0细胞的moi分别为0.1和1），在感染后的不同时间添加dynasoir，并在培养基中再存在2 h。按照上文（B）所述确定感染。数据是三个独立实验的平均值±SD。**，p<0.01，具有高度统计意义；***，p<0.001，极显著。
图7
图7
连接霉素A（ConcA）、莫能菌素和氯喹（CQ）对NDV融合和感染性的影响。（A） 对NDV融合的影响。在ConcA或莫能菌素存在下培养细胞1小时30分钟，在CQ存在下培养1小时。然后，将2μg R18-NDV在4°C下与细胞结合30分钟，如图1中的图例所示，在药物持续存在下进行融合。（B） ConcA和莫能菌素对NDV感染性的影响。细胞在ConcA或莫能菌素存在下孵育1小时30分钟，然后用rNDV-F3aa-mRFP以1的moi感染，除了0.1的moi的HeLa细胞。在清洗和培养24小时之前，药物在培养基中再存在4小时。NDV感染性的量化如图3中的图例所示。（C） CQ对NDV感染性的影响。细胞以1 moi感染rNDV-F3aa-mRFP，HeLa细胞除外，后者为0.1 moi；在不同时间添加药物：CQ 1h：感染前1h与药物预孵育的细胞；CQ：感染前1小时和感染后4小时与药物预孵育的细胞；感染后CQ：在感染后5小时加入药物，然后在药物存在下再孵育6小时。感染后24小时，NDV感染性被量化，如图3中的图例所示。（D） 用ConcA、莫能菌素或CQ处理细胞后，细胞感染NDV“Clone 30”，感染率为1。感染后24小时，通过基于FACS的免疫分析分析感染性，详见材料和方法。数据是G平均荧光值占对照组未处理和感染细胞的百分数，取100%。结果是三个独立实验的平均值±SD。*p<0.05，具有统计学意义：**p<0.01，非常显著；***，p<0.001，极显著。
图8
图8
保护病毒HN糖蛋白免受蛋白酶K消化。（A） ●●●●。病毒在4°C下附着于ELL-0细胞1小时。在37°C下孵育指定时间后开始进入。用蛋白酶K处理细胞，裂解，用多克隆抗NDV抗体进行Western blotting检测病毒HN蛋白。（B） 病毒在4°C下附着于MEB4（1、2、5和6道）和HeLa（3、4、7和8道）细胞1小时。然后将样品在37°C下培养10分钟（1、3、5和7道），或在4°C下保持10分钟（2、4、6和8道），在4℃下用蛋白酶K处理1小时，并按照材料和方法中的详细说明进行溶解。免疫印迹法检测NDV-HN蛋白。
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