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。2013年9月12日；154（6）：1380-9。
doi:10.1016/j.cell.2013.08.021。 Epub 2013年8月29日。

RNA-guided CRISPR Cas9的双重缺口增强基因组编辑特异性

F安然 1, 帕特里克·D·苏, Chie-Yu Lin先生, 乔纳森·古登堡, 西尔瓦娜·科纳曼, 亚历山大·特雷维诺, 大卫·A·斯科特, 井上阿祖, Shogo Matoba公司, 张毅（音）, 张峰（音）
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RNA-guided CRISPR Cas9的双重缺口增强基因组编辑特异性

F安然等。 单元格。 。

勘误表in

  • 单元格。2013年10月10日；155(2):479-80

摘要

有针对性的基因组编辑技术已经实现了广泛的研究和医学应用。来自微生物CRISPR-Cas系统的Cas9核酸酶通过20 nt引导序列靶向特定的基因组位点，该序列可以容忍与DNA靶点的某些不匹配，从而促进不希望的非靶点突变。在这里，我们描述了一种结合Cas9缺口酶突变体和成对导向RNA的方法，以引入靶向双链断裂。由于基因组中的单个缺口是以高保真度修复的，因此双链断裂需要通过适当的偏移导向RNA进行同步缺口切割，并扩大了靶切割的特定识别碱基的数量。我们证明，使用配对缺口可以将细胞系中的非靶向活性降低50-1500倍，并在不牺牲靶向切割效率的情况下促进小鼠合子中的基因敲除。这种多用途的策略支持各种需要高特异性的基因组编辑应用程序。

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数字

图1
图1。引导序列延伸对Cas9活性的影响
（A） 显示Cas9与靶向人类的匹配或不匹配sgRNA序列的示意图电磁X1基因座。（B） SURVEYOR分析凝胶显示含有20-nt和30-nt长引导序列的sgRNAs对靶点1的类似修饰。（C） Northern blot显示，在HEK 293FT细胞中，延伸的sgRNAs大部分恢复为20-nt导向长度的sgRNA。
图2
图2。双切口有助于人类细胞的有效基因组编辑
（A） 使用一对Cas9 D10A缺口酶（Cas9n）说明DNA双链断裂的示意图。D10A突变使Cas9只能裂解与sgRNA互补的链；一对sgRNA-Cas9n复合物可以同时切割两条链。sgRNA偏移被定义为给定sgRNA对的引导序列的PAM末端（5′）之间的距离。（B） 双缺口诱导NHEJ的效率与两个sgRNAs之间的偏移距离有关。所有使用的sgRNAs序列见表S1。(n个= 3; 误差条显示平均值±s.e.m.）（C）人类的代表性序列电磁X1Cas9n靶向的位点。sgRNA靶位点和PAM分别用蓝色和洋红色条表示。下面是显示代表性指数的选定序列。另见表S1和S2。
图3
图3。双缺口有助于人类细胞基因组的高效编辑
（A） 使用Cas9 D10A缺口酶（Cas9n）和两个sgRNAs说明DNA双链断裂（红色箭头）的示意图。5个序列同源于电磁X1选择sgRNA 1筛选Cas9n特异性。（B） Cas9n和一对sgRNA的靶向修饰率与野生型Cas9和单个sgRNA介导的靶向改造率相当（左面板）。Cas9-sgRNA1复合物产生显著的非靶点突变，而Cas9n未检测到非靶点位点修饰（右侧面板）。（C） 通过对五个非靶基因座的深度测序，测量了HEK 293FT细胞中sgRNA 1的非靶修饰水平。（D） sgRNA 1非靶点Cas9n和野生型Cas9的特异性比较。特异性比按目标/非目标修改率计算。(n个= 3; 误差条显示平均值±s.e.m.）（e，F）双刻痕最大限度地减少了两人的离目标修改VEGFA基因座同时保持高特异性（开/关靶修饰率，n个= 3; 误差条显示平均值±标准误差）。
图4
图4。双缺口允许通过人类细胞中的HDR插入基因组
（A） 图示通过单链寡核苷酸（ssODN）模板在由一对Cas9n酶创建的DSB处介导HDR的示意图。DSB站点的成功重组引入了欣dIII限制位点。（B） 限制性消化分析凝胶显示成功插入Hin公司在HEK 293FT细胞中通过双切口介导的HDR的dII切割位点。上层带是未修改的模板；较低的频带是Hin公司dIII解理产物。（C） 双缺口促进HUES62人类胚胎干细胞系中的HDR。HDR频率由深度测序确定。(n个= 3; 误差条显示平均值±标准误差）。（D） HDR效率取决于Cas9或Cas9n介导的缺口的配置。当ssODN同源臂中心附近出现缺口，导致5′-结果悬垂时，有助于HDR。HDR兼容的刻痕配置用红色箭头表示，用悬垂区域（黑线）分隔，不兼容的配置用棕色箭头和灰色线表示（顶面板）。为了进行比较，显示了sgRNAs 22、18、21、20、15、5与Cas9或Cas9n配对介导的HDR效率（底部面板，表S2）。
图5
图5。多重切割促进非HR介导的基因整合和基因组缺失
（A） 显示插入双链寡核苷酸（dsODN）供体片段的示意图，供体片段带有与Cas9双缺口产生的5′悬垂互补的悬垂。dsODN旨在删除本机电磁X1停止密码子，包含HA标签、3X FLAG标签、，后面的III限制场所，Myc公司表位标签和框架中的一个终止密码子，共148bp。如图所示，Sanger测序证实插入成功（筛选出1/37个克隆）。（B） 四种sgRNA与Cas9n的共同递送在DYRK1A基因座中产生长程基因组缺失（从0.5kb到6kb）。
图6
图6。Cas9双缺口介导小鼠胚胎高效吲哚形成
（A） Cas9双缺口瞄准鼠标的示意图机械2基因座。显示了与Cas9n-编码mRNA和在体外转录的sgRNA对。（B） 在多种浓度的sgRNA和野生型Cas9或Cas9n（从3ng/uL滴定到100ng/uL）下实现了有效的胚泡修饰。
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