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.2013年8月6日；8（8）：e72039。
doi:10.1371/journal.pone.0072039。 2013年印刷。

一种在神经前体细胞中展示的小鼠大脑三维免疫染色和光学成像方法

杰奎琳·格利夫 1, 杰森·P·勒奇, R马克·亨克尔曼, 布莱恩·尼曼
附属公司

一种在神经前体细胞中展示的小鼠大脑三维免疫染色和光学成像方法

杰奎琳·格里夫等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

了解作为疾病进展一部分发生的细胞分布变化是很重要的。这通常是通过标准切片和免疫染色实现的，然而，许多结构和细胞分布模式在二维中并不容易理解，包括神经干和祖细胞在小鼠前脑中的分布。由于渗透性差，小鼠大脑中的三维免疫染色受到阻碍。为此，我们开发了一种方法，可以使用商用抗体对小鼠大脑的整个半球进行染色。用光学投影断层扫描和连续双光子断层扫描对大脑进行胶质纤维酸性蛋白、双重皮质醇和巢蛋白染色的三维成像。这种染色方法很简单，结合了加热、时间和样品制备程序，易于实施，无需专门设备，使大多数实验室都能使用。

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数字

图1
图1。右旋糖酐-FITC在脑标本中的扩散。
如图所示，在不同条件下，用右旋糖酐-FITC“染色”4 mm半球的50µm切片24小时。右下角显示了从组织边缘到几个样本中心的平均一维强度分布，置信区间为90%。通过按时间平方根缩放线性扩散距离，将处理不同时间长度的样品组合在一起。提高温度、利用1%的PFA固定、冷冻/解冻处理和蛋白酶K消化（+FT）的组合使渗透性得到最大改善。
图2
图2。DCX染色验证。
DCX（A）的传统2D染色显示迁移神经母细胞的参考分布（红色）。大脑半球（B）的3D染色方法显示出类似的分布（箭头，a和B），除了一些额外的点状荧光（箭头，B）。从3D染色半球制备的冷冻切片用另一种二级抗体（绿色；C）重新染色，以突出3D染色期间二级抗体未结合的一级抗体；在3D染色法中，初级抗体与次级抗体结合（箭头）。在（D）中，与（C）来自同一大脑的额外冷冻切片用一级和二级抗体重新染色，以突出未被一级抗体占据的抗原结合位点。三维染色和重新染色细胞（箭头D）的重叠表明，在三维染色图像中没有遗漏DCX细胞。LV=侧脑室，比例尺=100µm
图3
图3。3D巢蛋白染色验证。
染色大脑半球的冷冻切片显示巢蛋白阳性细胞（红色；箭头，a）。存在一些额外的点状荧光（箭头，A）。用二级抗体（绿色；a）对切片进行再验证，以突出二级抗体未结合的一级抗体。未发现二级抗体未结合一级抗体的证据。还用一级和二级抗体（B）对切片进行重新染色，以突出未被占用的一级抗体抗原位点。原始3D嵌套染色与2D重新染色（箭头）重叠。LV=侧脑室，比例尺=100µm。
图4
图4。3D GFAP染色验证。
图中显示了GFAP染色大脑半球前部（a，B）和后部（C–F）的冷冻切片。用另一种二级抗体（绿色；A、C、D）重述强调了二级抗体未结合的一级抗体的存在。用一级和二级抗体（绿色；B、E、F）重述强调了最初未被一级占据的额外抗原位点的存在。箭头突出显示重新染色和原始3D染色的重叠部分。箭头突出显示只有在重新固定时才能看到的单元格。在前部，3D染色（红色）和再染色（A、B）之间仍有完全重叠。在大脑后部，海马体（C）和侧脑室后部（D）的次级抗体重新染色与原始3D染色重叠。用一级和二级抗体重新染色显示存在未被占用的一级抗体抗原位点，包括海马（E）和后侧脑室（F）中未用3D方法染色的一些细胞。LV=侧脑室，比例尺=100µm。
图5
图5。小鼠脑内DCX染色的3D OPT成像。
DCX染色的单半球的3D OPT显示为光学切片。DCX染色可见于侧脑室周围（A；i–iii）和齿状回颗粒下区（A；iv）。卡通显示了切片的位置。沿着侧脑室的DCX迁移神经母细胞链可以在3D（B）的脑室表面上看到。在（C）中，全脑的最大强度投影显示细胞沿着RMS迁移到嗅球（绿色阴影）。
图6
图6。小鼠脑内巢蛋白染色的3D OPT成像。
使用OPT的3D光学成像对巢蛋白染色的大脑半球进行成像。脑光学切片显示，侧脑室周围可见巢蛋白阳性细胞。卡通显示了切片的位置。
图7
图7。小鼠大脑中GFAP染色的3D OPT成像。
使用OPT三维光学成像对GFAP染色的大脑半球进行成像。大脑的光学切片显示，GFAP阳性细胞遍布整个大脑（A）。卡通显示了切片的位置。3D显示GFAP染色沿胼胝体（B）的分布。
图8
图8。小鼠脑内DCX染色的3D串行双光子断层成像。
使用串行双光子断层扫描对DCX染色的单个半球进行成像。显示了五个单独的切片，切片位置显示在右下角的动画中。对于每个切片，灰度图像显示解剖参考的自体荧光，彩色叠加显示DCX染色。神经突起可以区分（DCX在灰度插图i、ii中；箭头，插图i中）。染色模式与传统2D切片（插图为红色、iv和v）相当，但与背景信号的对比度较低。
图9
图9。小鼠大脑巢蛋白染色的3D串行双光子断层成像。
使用连续双光子断层摄影术对巢蛋白染色的大脑半球进行成像。切片位置如图所示。染色模式（灰度插图）与2D组织切片（彩色插图）相当。
图10
图10。小鼠脑内GFAP染色的3D串行双光子断层成像。
使用串行双光子断层扫描对GFAP染色的单侧大脑半球进行成像。通过大脑的光学切片显示出染色模式，这种模式在大脑中广泛存在。切片位置如图所示。灰度插图显示了典型的星形胶质细胞形态，与2D组织切片（彩色插图）相当。
图11
图11。GFAP染色脑内连续双光子断层扫描与传统免疫组织化学切片的比较。
将来自3D串行双光子断层扫描数据集（a，C）的切片与传统切片（B，D）进行比较。显示了可比较区域（E、G、I和F、H、J）的展开图像。罗斯特拉尔剖面（A、B和E、F）显示了可比较的结果。3D染色切片（G）的海马体染色较传统切片（H）浅。在边缘，3D染色比传统切片（J）产生更强烈的GFAP信号，背景（I）更高。浅色单元格的示例用（G）和（J）中的箭头高亮显示。（I）中的箭头突出了星形胶质细胞形态特征的一个例子。细胞密度图如（K，M）所示。罗斯特拉尔细胞密度（K，L）在两种方法之间相似。在尾侧区域（M，N），齿状回（白色箭头）的密度在3D染色中降低，而在皮层的某些区域（星号）似乎增加。细胞密度图（K–N）以黑色和白色显示，对应于<30个细胞/mm2和>1200个单元/mm2分别是。
图12
图12。DCX和巢蛋白染色小鼠大脑的3D OPT成像。
采用光学断层三维成像技术对同时染有DCX（红色）和nestin（蓝色）的单侧大脑半球进行成像。通过组织的光学切片表示样品的3D性质（A）。切片方向显示在卡通上。三维图像显示了DCX和巢蛋白染色细胞沿侧脑室表面的分布（B）。
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引用人

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工具书类

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