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.2013年8月;32(6):442-8.
doi:10.1007/s10930-013-9503-4。

人LAT 1(SLC7A5)氨基酸转运蛋白的克隆、在大肠杆菌中大规模过表达和成分纯化

附属公司

人LAT1(SLC7A5)氨基酸转运蛋白组分的克隆、大肠杆菌大规模过表达和纯化

米歇尔·加卢奇奥等。 蛋白质J. 2013年8月.

摘要

利用大肠杆菌首次获得了人LAT1转运体的高效表达。从HEK293细胞中扩增hLAT1 cDNA,并在pH6EX3载体中克隆。利用构建物pH6EX3-6His-hLAT1在大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS菌株中表达6His-h LAT1蛋白。IPTG在28°C诱导8 h后检测到最高表达水平。表达的蛋白质收集在细胞裂解液的不溶部分中。在SDS-PAGE上,多肽的表观分子量为40 kDa。在用红霉素溶解并用尿素变性后,用Ni(2+)螯合亲和层析纯化带有6His N末端标记的蛋白质,并用抗-His抗体进行鉴定。纯化后过表达蛋白的产量为3.5 mg/L(细胞培养)。从Imagene质粒中扩增出的人CD98 cDNA被克隆到pGEX-4T1中。利用构建物pGEX-4T1-hCD98在大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS菌株中表达GST-hCD98蛋白。在28°C下经IPTG诱导4小时后,在该病例中检测到最高表达水平。表达的蛋白质积累在细胞裂解液的可溶性部分。根据SDS-PAGE上的标记蛋白测定分子量;它约为110 kDa。通过与凝血酶孵育12 h,将GST从蛋白构建物中分离出来,并通过Sephadex G-200色谱分离hCD98(尺寸排除)。hCD98显示出62kDa的表观分子量,这是基于使用SDS-PAGE的分子量标记物测定的。CD98的产量为2 mg/L细胞培养。

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    1. 自然。1970年8月15日;227(5259):680-5-公共医学
    1. 分析生物化学。1975年3月;64(1):136-41-公共医学
    1. 实验生理学。1990年1月;75(1):3-26-公共医学
    1. 蛋白质实验纯化,2013年1月;87(1):35-40-公共医学
    1. 生物化学与生物物理研究委员会。2012年5月25日;422(1):59-63-公共医学

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