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.2013年12月15日；22(24):4988-5000.
doi:10.1093/hmg/ddt346。 Epub 2013年7月25日。

外泌体中LRRK2的分泌受14-3-3调节

凯尔·B·弗雷泽 1, 马克·S·莫尔, Joáo P L Daher, 菲利普·韦伯, 杰里·威廉姆斯, 嘉莉·A·斯图尔特, 塔琳娜·亚库比亚, 丽塔·M·考威尔, 泰杰·多克兰, 童业, 陈东泉, 基因P Siegal, 罗伯特·A·加莱姆莫, 埃尔皮达·齐卡, 达伦·J·摩尔, 大卫·G·斯坦达尔特, 小岛京子, 詹姆斯·莫布里, 安德鲁·韦斯特
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外泌体中LRRK2的分泌受14-3-3调节

凯尔·B·弗雷泽等。 人类分子遗传学. .

摘要

富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）基因突变可导致晚发性帕金森病（PD）。新的证据表明LRRK2在内吞途径中发挥作用。在这里，我们表明LRRK2在细胞外微泡（即外泌体）中从天然表达LRRK_2的细胞中释放。LRRK2定位于肾脏中的集合管上皮细胞，该细胞积极将外泌体分泌到尿液中。纯化的尿外泌体含有二聚和磷酸化的LRRK2蛋白。我们提供了尿外泌体中1673个蛋白质的定量蛋白质组图谱，并发现已知的LRRK2相互作用物（包括14-3-3）是一些最丰富的外泌体内蛋白质。14-3-3 LRRK2与14-3-3抑制剂相互作用的破坏或通过急性LRRK2激酶抑制有效阻断外泌体中LRRK2的释放，但LRRK2的家族性突变对分泌没有影响。尽管在一些PD患者和年龄匹配的对照组中检测到非常高的LRRK2水平，但在PD患者的泌尿外泌体中，LRRK_2水平总体上是可比较的，但变化很大。我们进一步表征了培养中神经元和巨噬细胞中LRRK2外显子的释放，发现LRRK2-阳性外显子在脑脊液（CSF）中循环。总之，这些结果确定了LRRK2细胞外释放的途径，阐明了LRRK14-3-3相互作用的一个功能，并为在临床试验中利用LRRK_2作为生物标记物提供了基础。

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数字

图1。
图1。
LRRK2在泌尿系外泌体中的定位。(A类)将人类尿液处理成等量的上清液S100（外显子缺失）、P100（外泌子富集）或P100洗涤缓冲液。重组LRRK2为Δ970-LRRK 2（Invitrogen）。(B类)在37°C下，用或不用200 ng胰蛋白酶处理10微克纯化尿外泌体，用或不用1%Triton X-100处理5分钟。n.s.是非特异性带。(C类)P100尿液外泌体通过密度梯度分离，并检测指示蛋白的表达。(D类)典型的低温EM图像，比例尺为50 nm。(E类)用STED显微镜观察尿外泌体LRRK2-荧光成像，标尺为500 nm。(F类)LRRK2（绿色）与TSG101或CD9的荧光共同标记。箭头表示正共定位，比例尺为2μm。(克)用或不用1%Triton X-100处理的纯化尿外泌体LRRK2蛋白的Blue NativePAGE。(H（H）)比较10µg纯化尿外泌体中LRRK2的相对表达和磷酸-胺935与10µg人脑（额叶皮层）蛋白裂解物或1 ng从HEK-293 T细胞分离的重组LRRK2。
图2。
图2。
LRRK2在肾脏中的定位和泌尿系外泌体的蛋白质组学特征。(A类)WT或(B类)KO动物，用LRRK2抗体（c41-2，Epitomics）染色并用H&E复染。低倍图像的比例尺（左侧面板）为200μm，高倍图像为25μm（右侧面板）。(C类)与已知的LRRK2蛋白相互作用物相比，定量TMT-MudPIT结果显示了最丰富的外体蛋白。误差条是由六个不同等压标签的光谱计数生成的SD。(D类)通过组织特异性基因表达和调控数据库鉴定的尿液外体蛋白。
图3。
图3。
LRRK2外显子释放受14-3-3调节(A类)从表达LRRK2蛋白的HEK-293 T细胞纯化的外泌体的典型冷冻电镜图像，比例尺为100 nm。(B类)表达LRRK2蛋白的HEK-293 T细胞与eGFP、搅乱的difopein（difopen的对照物，见（41））或difopeen共同转染。LRRK2被免疫沉淀，并从培养基中收集外泌体。(C、 D类)测量p1503自动磷酸化（Alpha Screen信号）的剂量-反应曲线在体外在指定的药物浓度下进行激酶分析。集成电路50通过非线性回归计算浓度。(E类)用所示药物（1µ米)或同等DMSO浓度（0.01%）36小时。将细胞收集到总细胞裂解物、LRRK2免疫沉淀物和外泌体中。
图4。
图4。
LRRK2细胞质定位受14-3-3调节(A–H)表达mKate2标记的LRRK2（N末端标记）的HEK-293T细胞的代表性共焦图像，细胞经所示药物处理和/或与所示结构共同转染。药物用量为1µ米浓度36小时。
图5。
图5。
LRRK2突变缺乏作用，外显子中α-突触核蛋白缺乏定位(A类)使用共焦免疫荧光法对mKate2-LRRK2（红色信号）和MVB标记TSG101进行免疫荧光共定位。显示了一个具有代表性的单元格。（B） 将具有指示突变的LRRK2-myc瞬时转染到HEK-293T细胞和转染48小时后收集的外泌体和胞浆裂解物中。(C类)转染mKate2-LRRK2（红色信号）和α-突触核蛋白（蓝色信号）的HEK-293 T细胞的纯化外显子。未观察到重叠的蓝色/红色信号。所有数据均代表至少三个独立实验，比例尺代表10µm。
图6。
图6。
临床人群外体LRRK2的特征。(A类)从帕金森病患者和对照组患者的尿液中分离出外显子，并用western blot在四次独立运行中分析裂解产物。“池”值是由20个PD和15个对照个体的每个外显子裂解物的10%混合在一起的样品，允许比较在不同凝胶上分析的样品。(B–D)显示标准化为TSG101表达的相对LRRK2表达的图；每个主题的数据点是四次独立运行的平均值，删除了主题的异常值。误差线为SEM，水平线为队列平均值。(E类)与具有平均LRRK2和TSG101表达的队列几何平均值（GM）样本相比，对受PD影响的异常受试者进行滴定。(F类)（E）中分析的PD患者的临床总结。(克)在一周的时间里，从一个神经系统正常的个体收集尿液外泌体，并分析LRRK2和TSG101的表达。
图7。
图7。
巨噬细胞分泌LRRK2外体(A类)用或不使用LPS（100 ng/ml）和24小时后收集的外泌体和细胞胞浆处理巨噬细胞系原始264.7细胞。(B类)从WT或G2019S-BAC小鼠和LPS转导24小时后收集的外泌体和胞浆裂解物中分离出收集到的硫乙醇酸初级巨噬细胞。(C类)（B）外体LRRK2的定量。(D、 E类)从LRRK2 KO或LRRK2BAC-转基因小鼠分离的巯基乙酸收集的外周初级巨噬细胞的共聚焦图像被染色以检测LRRK2-蛋白（抗体c41-2）或TSG101。在固定细胞之前，使用LPS（100 ng/ml）24小时。显示了具有代表性的图像；结果是三个独立实验的典型结果。所有面板的比例尺均为10μm。
图8。
图8。
神经元和脑脊液中LRRK2外显子分泌。(A类)WT或LRRK2 KO小鼠纹状体代表性冠状切片。箭头表示纹状体中的纹状斑块中的LRRK2阳性细胞与侧脑室并列。比例尺为0.2 mm(B类)从人脑脊液中分离出的外泌体的典型冷冻电镜图像。比例尺为50 nm。(C类)纯化脑脊液外泌体中LRRK2的Western blot定量（Δ970-rLRRK3，Invitrogen）。装载到车道上的CSF代表相当于1 ml CSF的外泌体。(D、 E类)用LRRK2腺病毒转导的原代皮层神经元在转导后48小时被裂解并纯化外泌体。神经元分泌的外泌体中相对G2019S和WT LRRK2的定量，归一化为细胞溶质LRRK_2水平。(F类)原代神经元培养10天在体外，在5天时用低浓度（约0.1多重感染）的WT-LRRK2病毒转导在体外，对LRRK2蛋白（抗体N241）或TSG101进行染色。箭头显示共标记小泡，树突通过强烈的MAP2标记识别（参见补充材料，图S3和S4). 白色刻度条为5μm。
图9。
图9。
LRRK2外泌体释放的拟议模型。
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