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.2013年8月14日；32(16):2275-86.
doi:10.1038/emboj.2013.160。 Epub 2013年7月23日。

神经元碳酸酐酶VII提供GABA能的兴奋性驱动，加剧发热性癫痫发作

伊娃·鲁苏武奥里 1, 安捷·胡布纳（Antje K Huebner）, 伊利亚·基里尔金, 亚历克谢·尤金, 彼得·布莱斯, 穆罕默德·赫尔米, Hyo Jung Kang先生, 马利克·埃尔·穆阿耶德, J克里斯托弗·亨宁斯, Juha Voipio公司, 内纳德·什斯坦, 克里斯蒂安·阿赫布纳, 凯凯拉
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神经元碳酸酐酶VII提供GABA能的兴奋性驱动，加剧发热性癫痫发作

伊娃·鲁苏武奥里等人。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

已知脑碳酸酐酶（CA）可以调节神经元信号传导。使用新型CA VII（Car7）基因敲除（KO）小鼠、CA II（Car2）KO和CA II/VII双KO，我们发现成熟的海马锥体神经元具有两种细胞溶质亚型。CA VII主要由出生后第10天左右开始的神经元表达（P10）。普遍存在的亚型II在P20的神经元中表达。这两种亚型在GABAA受体强烈激活期间增强碳酸氢盐驱动的GABA能兴奋。P13-14 CA VII KO小鼠表现出实验性热性惊厥（eFS）非典型的行为表现，并且完全没有出现电图惊厥。低剂量地西泮可促进P13-P14大鼠幼崽的eFS，而高浓度的地西泮可阻止癫痫发作，从而抑制呼吸。因此，GABA能兴奋会加重呼吸性碱中毒依赖性eFS。我们发现，在儿童出现热性惊厥（FS）的年龄之前，CA VII mRNA在人类大脑皮层中表达。我们的数据表明，CA VII是年龄依赖性神经元pH调节的关键分子，从而影响FS的生成。

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图1
图1
CA VII-缺陷小鼠的产生。(A类)针对汽车7轨迹。内源性汽车7轨迹（顶部）。目标构造（中间）。Cre介导重组后的靶位点（底部）。外显子表示为灰色方框，loxP位点表示为箭头。(B类)CA VII的多组织northern印迹。在P56小鼠中，CA VII在包括大脑和脊髓在内的中枢神经系统中显著表达。Gapdh公司用作装载控制。(C类)CA VII蛋白表达的发育概况。对整个海马蛋白裂解物的Western blot分析显示，CA VII水平从P3增加到P30。KO组织中的蛋白裂解物中没有适当大小的带（～30 kDa）。(D类)在培养细胞蛋白裂解产物的western blot中，CA VII在混合胶质细胞/神经元培养物中检测到，但在胶质细胞培养物中未检测到。GFAP检测证实所有培养物中均存在星形胶质细胞。肌动蛋白在C类和D类.
图2
图2
小鼠CA1锥体神经元胞浆CA活性的发展基于亚型VII和II的顺序表达。(A类)原始单细胞pH值我P5和P14 WT和P14 CA VII KO神经元的示踪及其时间导数（基线pH值我分别为7.21、7.13和7.11）。一氧化碳超熔合2/HCO公司三−-游离HEPES溶液（上水平条）引起细胞内碱化，在P14 WT中碱化较大，并被100μM乙酰唑胺（AZ，下水平条）抑制，表明存在CA活性（见补充材料和方法）。通过添加10μM苯甲酰胺（一种渗透性较差的CA抑制剂）来排除AZ对细胞外CA的可能影响。插图显示了P14 WT中CA1锥体神经元的BCECF荧光信号和Dodt梯度对比图像的叠加（比例尺10μm）。(B类)使用细胞溶质CA活性检测方法获得的结果总结，如A所示，并量化为显示细胞溶质CA活性的细胞百分比。仅在>P35时获得CA II KO和CA II/VII KO神经元的数据。每根棒材都显示了测试的电池数量。WT小鼠在不同年龄段的动物数量为n个=3（P5–8），n个=2（第10–11页），n个=3（第14–16页），n个=2（第17–18页），n个=2（P20-30）和n个=2（>P35）；CA VII KO小鼠的数量为n个=3（P5-8），n个=2（第10–11页），n个=5（第14–16页），n个=3（第17–18页），n个=4（P20–30）和n个=2（>P35）；对于CA II KO和CA II/CA VII KO小鼠，数量为n个=2（>第35页）。(C类)典型的单锥体神经元pH值我CO退出引起的反应2/HCO公司三−（横条，HEPES）切片来自>P35 WT、CA VII KO和CA II/VII KO。WT（P39，基线pH值我7.01）和CA VII KO神经元（第40页，第7.06页），而CA II/VI KO的碱化发展缓慢得多（第46页，第704页）。
图3
图3
CA VII和CA II同样增强GABAA类CA1锥体神经元的R介导去极化。(A类)电刺激（40脉冲，100 Hz放射层/腔隙层-分子(sr/slm）AP5/CNQX/CGP55845）存在时，在WT中引起兴奋性GABA能反应，但在CA VII KO神经元中没有。Picrotoxin阻断了双相反应（PiTX 90μM；n个=3/基因型）。WT中去极化偏移的平均初始斜率快于CA VII KO（13.53±1.27对6.39±0.96mV/s，P（P）<0.001，学生t吨-测试）。WT和CA VII KO神经元的静息膜电位没有差异（分别为−71.0±1.1和−72.3±1.4 mV；n个=两种基因型的15个神经元，P（P）=0.47，学生的t吨-测试）。(B类)微量注射GABA（5 mM，持续100 ms，sr/slm公司CGP55845/TTX存在时的边界（箭头）在WT神经元（黑色）中诱导了明显的去极化，而在没有CO的情况下这种去极化被消除2/HCO公司三−（灰色）。CA VII KO的去极化较小（红色）。条形图显示了P12–16 WT和CA VII KO中的GABA能量平均峰值去极化（13.3±0.5 vs.8.3±0.6 mV，P（P）<0.001，学生t吨-测试）。(C类)在AP5/CNQX/CGP55845存在下，微量注射GABA（5 mM，sr/slm公司边界）在注射8ms后，已经在WT切片中触发了SR 95531敏感场电位峰值，而即使注射16ms也几乎没有在CA VII KO中触发任何峰值（左）。绘制了P12–16 WT和CA VII KO中GABA喘息持续时间的平均峰值数(P（P）<0.01和P（P）<0.001，学生t吨-测试；右侧）。(D类)P35后，在CGP55845/TTX存在下，GABA微注射（箭头）的去极化在WT（黑色）、CA VII KO（红色）和CA II KO（蓝色）中无法区分，但在CA II/VII GO（绿色）中较小。在没有CO的情况下，WT的去极化被废除2/HCO公司三−（灰色，n个=5). 条形图总结了每个基因型的平均峰值去极化（右；ANOVA，Bonferroni）*P（P）<0.05, **P（P）<0.01和***P（P）<0.001. 误差条表示s.e.m.和n个是切片数(C类)或测试的细胞（每片一个细胞）(A类,B类和D类).
图4
图4
CA VII促进P13–14小鼠的实验性发热性癫痫发作。(A类)WT和CA VII KO小鼠在高温（HT）期间硬膜外EEG记录的代表性原始痕迹。WT中可靠诱发癫痫(n个=9）但不在CA VII KO中(n个=7). (B类)WT和CA VII KO小鼠呼吸频率的样本记录。在HT期间，两种基因型（WT 272±28次/min和CA VII KO 279±12次/min）的基线呼吸频率均增加（WT 153±11次/min，CA VII GO 157±8次/min。条形图总结了WT（177±12%）和CA VII KO小鼠（178±6%，P（P）=0.98). (C类)在WT和CA VII KO小鼠中，过热导致血液pH值发生类似的碱中毒。在对照条件下，两种基因型的血液pH值没有差异(P（P）=0.37）或HT期间(P（P）=0.44). (D类)在连续存在5%CO的情况下诱导高温时，未在WT小鼠中检测到电惊厥2(n个=5). 误差条表示s.e.m.，全部P（P）-值基于学生的t吨-测试(***P（P）<0.001），动物数量在条形图中给出。直肠温度在迹线上方给出。
图5
图5
GABA公司A类-受体介导的对实验性热性惊厥的调节。(A类)安定（DZP，150μg/kg）降低P14大鼠幼崽癫痫发作的潜伏期(P（P）<0.05). 50μg/kg和盐水注射动物之间没有统计学差异。2.5 mg/kg的DZP完全阻止了癫痫发作。在高温（HT）发作前15分钟腹腔注射DZP。(B类)150μg/kg剂量的安定对基线呼吸频率没有影响，注射地西泮和生理盐水的大鼠的HT也诱导了呼吸频率的类似增加(P（P）>0.05). 在较高浓度（2.5 mg/kg）下，DZP显著抑制呼吸(P（P）<0.01）和HT只导致呼吸频率略有增加。(C类)在切片制备过程中，DZP（1μM）增强了高频刺激（40个脉冲，100 Hz，水平条）诱发的GABAA类R介导的去极化。P14大鼠幼崽切片中刺激至边缘的样本痕迹放射层和腔隙分子层在AP5、CNQX和CGP 55845在场的情况下给出。条形图总结了DZP对去极化持续时间（达到半最大值的时间）和与去极化相相关的动作电位数量的影响。P（P）-值(*P（P）<0.05, **P（P）<0.01和***P（P）<0.001）基于ANOVA，Bonferroni(A类,B类)或学生的t吨-测试(C类)，误差条表示s.e.m.动物数量(A类,B类)或单元格(C类)如条形图所示。
图6
图6
人脑发育过程中CA VII的表达。线条图显示日志2-转化外显子阵列信号强度（左），以及CA VII绝对拷贝数与Gapdh公司从胎儿早期到成年晚期，通过新皮质（NCX）和海马（HIP）的液滴数字PCR（ddPCR，右）。第7和第8周期之间的实线将产前和产后周期分开。
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