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.2013年7月18日；499(7458):295-300.
doi:10.1038/nature12354。

用于神经活动成像的超灵敏荧光蛋白

蔡文晨 1, 特雷弗·J·沃迪尔, 孙毅, 斯特凡·普尔弗, 萨宾·勒宁格, 艾米·鲍汉, 埃里克·施赖特, 雷克斯·A·克尔, 迈克尔·B·奥格, 维韦克·贾亚拉曼, 洛伦·卢格, 卡罗·斯弗波达, 道格拉斯·S·金
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用于神经活动成像的超灵敏荧光蛋白

蔡文晨等。 自然. .

摘要

荧光钙传感器广泛用于神经活动的成像。利用基于结构的突变和基于神经的筛选，我们开发了一系列超灵敏蛋白钙传感器（GCaMP6），其性能优于培养神经元和斑马鱼、苍蝇和小鼠体内的其他传感器。在小鼠视皮层2/3层锥体神经元中，GCaMP6可靠地检测到神经元体中的单动作电位和单个树突棘中的定向调节突触钙瞬变。结构持久性脊椎的方向调整在数周的时间尺度内基本稳定。脊椎种群的平均方向调谐预测了其父细胞的调谐。虽然GABA能神经元的体细胞显示出很少的方向调谐，但它们的树突包括高度调谐的树突片段（5-40-µm长）。因此，GCaMP6传感器为在多个空间和时间尺度上了解神经电路的组织和动态提供了新的窗口。

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数字

图1
图1。分离神经元的GCaMP突变和筛选
a、，GCaMP结构,以及与GCaMP5G相关的不同GCaMP变体的突变。b、，GCaMP3、5G、6f、6m、6s和OGB1-AM在多个神经元和微孔中的平均响应。顶部，荧光变化响应1个动作电位。底部，10个动作电位。c、，筛选结果，447个GCaMP。顶部，响应1个动作电位的荧光变化（垂直条，ΔF/F0; 绿色条，OGB1-AM，左侧；黑条，单个GCaMP突变；红条，组合突变；蓝色，GCaMP6指标）和不同动作电位刺激的显著性值（彩色图）。10个动作电位后的中、半衰减时间。底部，静止荧光，F0归一化为核樱桃荧光。红线，GCaMP3级别；绿线，GCaMP5G级；蓝线，OGB1-AM级。d-g，GCaMP传感器和OGB1-AM（蓝色）作为刺激强度函数的比较（颜色如b所示）。日期：，响应幅度；e、，信噪比；f中，半衰变时间；g、 峰值时间（刺激抵消后）。误差条对应于s.e.m（对于GCaMP3、GCaMP5G、OGB1-AM、6f、6m、6s，n分别为300、16、8、11、13、11口井）。
图2
图2。GCaMP6在小鼠视觉皮层的表现
a、，上图，实验示意图。底部，显示神经元根据GCaMP5G（左）和GCaMP6s（右）的首选方向（色调）和响应幅度（亮度）进行彩色编码的视野。b、，表达GCaMP6的三个神经元的痕迹示例。叠加单次扫描（灰色）和5次扫描（黑色）的平均值。光栅运动方向（8个方向）如轨迹（箭头）所示。c、，表达GCaMP6f的三个神经元的痕迹示例。叠加单个扫描（灰色）和5个扫描（青色）的平均值。日期：，顶部，荧光变化的高倍视图对应于b（黑色）和c（青色）中的红色方框，归一化为响应峰值。底部，用GCaMP5G、OGB1-AM、6f、6s转导的1 Hz漂移光栅驱动的神经元的傅里叶谱归一化为0 Hz的响应幅度。e、，当加载不同的钙指示剂时，被评分为对视觉刺激有反应的细胞部分。误差条对应于s.e.m.（GCaMP3、5G、OGB1-AM、6f、6m、6s的n=70、39、23、38、21、34 FOV）。GCaMP3、5G和OGB1-AM数据来自参考。f中，荧光在细胞中的分布在优选方向上发生变化。
图3
图3。视觉皮层的联合成像和电生理学
a、，表达GCaMP6s（顶部）和GCaMP5f（底部）的神经元中的同步荧光动力学和峰值。每个脉冲的峰值数量显示在轨迹下方（单个峰值用星号表示）。左插图中，用记录移液管图示了一个表达GCaMP6的神经元。b、，放大动作电位的爆发。顶部，GCaMP6；底部，GCaMP6f。c、，一个动作电位引起的荧光变化。顶部，GCaMP6；底部，GCaMP6f。日期：，不同钙指示剂对一个动作电位的响应中位荧光变化。阴影对应于s.e.m.，n=9（GCaMP5K，数据来自ref），11（GCaMP 6f），10（GCaMPa 6m），9（GCa MP6s）个单元格。GCaMP5K和GCaMP5AG具有类似的特性。e、，峰值荧光变化是250ms仓中动作电位数量的函数（5K:n=161、65、22、4个事件，用于1、2、3、4个动作电位；6f:n=366、120、50、15、7个事件，用于1、2、3、4、5个动作电位；6m:n=354、105、31、11、7个事件，用于1、2、3、4、5个动作电位；6s：n=250，60，20，5，4个事件，1，2，3，4，5动作电位）。误差条对应于s.e.m。f中，GCaMP指标比较。左，以1%假阳性率检测到的孤立峰值的分数。中等衰减时间。对，将时间增加到峰值。误差条对应于s.e.m。
图4
图4。视皮层树突状棘的成像活性
a、，表达GCaMP6的L2/3树突状分支的图像。感兴趣区域（ROI）以虚线圆圈表示（红色，棘状；黄色，树枝状）。b、，荧光变化图（ΔF=F响应-F类基线)响应8个不同方向的漂移光栅。c、，基于像素的方向偏好地图。日期：，树枝状棘（s1-s3）和相邻树枝状轴（d1-d3）对不同方向漂移光栅的响应（对应于一).e、，单个脊椎的方向调整（s1、s2、s3）。误差条对应于s.e.m（n=5次试验）。f中，显示可检测到的钙瞬变（活性）和对视觉刺激（反应性）有反应的脊椎部分（定义见方法）（228个脊椎；15个树突；4只小鼠）。克，方向选择性指数在视觉反应性脊椎（62个脊椎）上的分布。小时，连续成像320秒以上单个树突棘的基线荧光（228个棘；15个树突；4只小鼠；误差条反映了跨越棘的s.e.m.）。我，左边，同样的GCaMP6标记的脊柱在数周内成像。右图，定向漂移光栅的荧光响应。插图，成像脊椎的父体。j、，随着时间的推移测量的单个棘的定向选择性（与我).k的情况下，在间隔一周的两次成像过程中，脊椎的首选方向为顶部。在本分析中，相反的刺激方向被认为是等效的。底部是ΔOri的分布（两个会话之间首选方向的差异）。
图5
图5。树突棘种群的取向偏好预测其亲本神经元的取向偏好
a、，表达GCaMP6s的2/3层锥体神经元（深度，120μm）对定向漂移光栅（顶部）的体细胞荧光反应以及相应的调谐曲线（底部，归一化）。b、，树突乔木的重建（红色树突，树突以d表示；虚线方框，其他图像区域）。c、，顶部，视觉反应性脊椎的荧光反应（84/298）按其首选方向排序（5次试验的平均值）。每行显示一条归一化为其峰值的脊椎。底部，总计ΔF/F0跨越所有脊椎（无标准化）。日期：，成像树突子集上定向选择棘的位置（对应于b中的红色树突）。圆圈的大小对应于平均ΔF/F0在首选刺激下，颜色表示首选方向，颜色的饱和度编码方向选择性指数（OSI=1，饱和颜色；OSI=0，白色）。e、，顶部，躯体ΔF/F的调谐曲线。底部，脊椎ΔF/F的总和。细胞1对应于面板a-d。f中，5个神经元（与e（电子）). 转向曲线与输出响应的首选方向对齐（0度）。将平均值归一化。克，树突棘择优取向的分布（5个细胞；取样的棘数：298166137278116）。小时，视觉反应性脊髓倾向于与突触后细胞的首选方向成0、45或90度角。在本分析中，相反的刺激方向被认为是等效的。误差条对应于s.e.m。
图6
图6。GABA能中间神经元树突中的定向调节结构域
a、，一个表达GCaMP6s的中间神经元（体深，250μm）事后（post-hoc）作为一个小蛋白阳性中间神经元。b、，体细胞荧光变为定向漂移光栅（与a中的细胞相同）。底部极坐标图。c、，基于GCaMP6s荧光的树枝状乔木的重建。日期：，左边，细胞的树突（c中为红色）沿着其整个长度成像。彩色方块表示树突状位点显示出显著的方向调谐（p<0.01，8个刺激方向的方差分析）。每个方块的颜色表示局部首选方向，颜色的饱和度编码方向选择性指数（OSI=1，饱和颜色；OSI=0，白色）。对，例如，具有不同取向偏好的四个位置的树枝状荧光变化和相应的极坐标图。比例尺：10s；50%ΔF/F。e、，根据中方框对应的树突状钙信号进行缩放d。信号显示漂移光栅频率（1 Hz）的调制。
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中的注释

  • 钙传感器达到了新的高度。
    帕斯特拉纳E。 帕斯特拉纳E。 自然方法。2013年9月；10(9):824. doi:10.1038/nmeth.2628。 自然方法。2013 PMID：24143827 没有可用的摘要。

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