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.2013年7月18日；4（7）：e731。
doi:10.1038/cddis.2013.254。

Sirt3与OGG1的相互作用有助于线粒体DNA的修复，并防止氧化应激下细胞凋亡

Y Cheng先生 1, X任, A S P Gowda公司, Y Shan（Y山）, L Zhang先生, Y-S元, R帕特尔, H Wu先生, K休伯·基纳, J W杨, D刘, T E斯普拉特, J-M杨
附属公司

Sirt3与OGG1的相互作用有助于线粒体DNA的修复，并防止氧化应激下细胞凋亡

Y Cheng先生等。 细胞死亡病. .

摘要

Sirtuin 3（Sirt3）是一种主要的线粒体NAD（+）依赖性脱乙酰酶，以各种线粒体蛋白质为靶标进行赖氨酸脱乙酰化，并调节重要的细胞功能，如能量代谢、衰老和应激反应。在本研究中，我们鉴定了人8-氧代鸟嘌呤-DNA糖苷酶1（OGG1）作为Sirt3的新靶蛋白，OGG1是一种DNA修复酶，可从受损基因组中切除7,8-二氢-8-氧代鸟嘌呤（8-oxoG）。我们发现Sirt3与OGG1物理相关，并使这种DNA糖苷酶脱乙酰，Sirt3的脱乙酰作用阻止了OGG1蛋白的降解并控制了其切割活性。我们进一步表明，Sirt3对OGG1乙酰化和转换的调节在修复线粒体DNA（mtDNA）损伤、保护线粒体完整性和防止氧化应激下凋亡细胞死亡方面起着关键作用。我们观察到，电离辐射后，Sirt3表达沉默的人类肿瘤细胞表现出线粒体DNA的氧化损伤恶化，通过8-oxoG和4977个常见缺失的积累进行测量，与未沉默Sirt3表达的细胞相比，显示出更严重的线粒体功能障碍和更大的细胞凋亡。本文报道的结果不仅揭示了Sirt3在保护线粒体基因组免受氧化损伤和保护免受基因毒性应激诱导的凋亡细胞死亡方面的新功能和机制，还提供了支持新的线粒体DNA修复途径的证据。

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数字

图1
图1
Sirt3对OGG1脱乙酰和切割活性的影响。(一)Sirt3对OGG1的脱乙酰作用体内：用Flag-Sirt3表达质粒或Sirt3 siRNA转染人脑胶质瘤细胞LN229；分别以Flag质粒或非靶向siRNA转染作为对照。western blot检测Sirt3和乙酰-OGG1水平。Tubulin被用作负荷控制。(b条)Sirt3对OGG1的脱乙酰作用在体外：从转染Flag-OGG1表达质粒或Flag-Sirt3表达质粒的HEK293T细胞中纯化的OGG1和Sirt3蛋白（左面板）在存在或不存在1mM NAD的情况下培养+脱乙酰分析缓冲液（50 mM Tris–HCl（pH 9.0），4 mM MgCl2，50 mM NaCl，0.5 mM二硫苏糖醇）在30°C下持续3 h。孵育结束时，使用抗乙酰-OGG1、Sirt3或OGG1的抗体进行western blot（右侧面板）。(c（c）)Sirt3敲除抑制OGG1切割8-oxoG：oxoG的切除由线粒体裂解物催化。从转染了干扰siRNA和Sirt3 siRNA的LN229细胞中分离出线粒体。对于OGG1裂解反应，将不同数量的线粒体裂解物与20 nM的oxoG-duplex在37°C孵育30分钟，然后通过PAGE进行分析，并通过Image Quant软件进行分析。每个点代表平均值±S。三个相同实验的EP（P）-值
图2
图2
Sirt3与OGG1的物理关联。(一)用正常IgG或OGG1抗体免疫沉淀LN229细胞的提取物，然后用Sirt3抗体免疫印迹。(b条)用正常IgG或Sirt3抗体免疫沉淀LN229细胞的提取物，然后用OGG1抗体免疫印迹。(c（c）)用Flag抗体对转染Flag标记的Sirt3质粒的LN229细胞株的细胞裂解物进行免疫沉淀，然后用抗OGG1或抗Sirt3抗体对免疫沉淀进行免疫印迹。(d日)用Flag抗体对转染Flag标记OGG1质粒的LN229细胞株的细胞裂解物进行免疫沉淀，然后用抗Sirt3或抗OGG1抗体对免疫沉淀进行免疫印迹
图3
图3
沉默Sirt3表达可促进钙蛋白酶对OGG1的降解。(一)用Sirt3 siRNA或Flag-Sirt3质粒转染LN229或T98G细胞。western blot检测OGG1和Sirt3水平。Tubulin被用作负荷控制。(b条)用非靶向RNA或Sirt3靶向siRNA转染LN229或T98G细胞，然后用辐射处理或不处理。western blot检测Sirt3和OGG1水平。(c（c）)用辐射处理或不处理表达Sirt3 shRNA或非靶向RNA的LN229细胞。在治疗结束时，使用线粒体分离试剂盒（Pierce）分离线粒体。western blot检测Sirt3和OGG1蛋白水平。Prohibitin被用作装载控制。(d日)用Sirt3 siRNA转染LN229或T98G细胞，该siRNA仅针对Sirt3 mRNA的非编码序列，然后用Flag-Sirt3表达质粒转染。western blot检测OGG1和Sirt3蛋白水平。(e（电子）)用非靶向RNA或靶向Sirt3的siRNA转染LN229细胞，然后用10μg/ml CHX。在指定的时间点，用western blot检测OGG1蛋白。每个点代表平均值±S。三个实验的E**P（P）<0.01. (（f）)有或无Sirt3表达沉默的LN229细胞未经治疗或用ALLM或E64d治疗。20小时后，用western blot检测Sirt3和OGG1的蛋白水平。每个条形代表平均值±S。三个实验的E**P（P）<0.01
图4
图4
沉默Sirt3表达会增加线粒体中8-oxoG的积累和线粒体DNA 4977 bp的缺失。(一)对有或无Sirt3表达沉默的LN229细胞进行放射治疗（16Gy）。20小时后，用8-oxoG抗体对细胞进行免疫染色。8-氧代G染色用荧光显微镜观察。(b条)8-oxoG在线粒体中的积累通过其与线粒体选择性染料MitoTracker Red的共定位（绿色）来证明。细胞核用DAPI（蓝色）进行复染。(c（c）和d日)用非靶向RNA或Sirt3靶向siRNA转染LN229细胞，然后用16或32 Gy处理γ-辐照。未经处理的细胞作为对照。在治疗结束时，提取细胞DNA，并对mtDNA 4977 bp缺失进行PCR分析(c（c）)和野生型线粒体DNA(d日)已执行
图5
图5
Sirt3表达的下调加剧了辐射对线粒体功能的影响。(一)用非靶向RNA或Sirt3靶向siRNA转染LN229细胞，然后用辐射（16 Gy）处理或不处理。在治疗结束时，通过胰蛋白酶化收集细胞，固定，并嵌入丁香树脂中。用JEOL 1200EX透射电子显微镜在80 kV电压下切割并检查薄片（90 nm）。(b条)在无辐射的情况下，对有或无Sirt3表达沉默的LN229细胞按10所示顺序进行处理μM Olig，3岁μM FCCP、1 M 2DG和10μM腐烂。使用Seahorse Bioscience细胞外通量分析仪实时监测OCR（平均值±S.D。，n个=3). (c（c）)收集在无辐射情况下Sirt3表达沉默或无沉默的LN229细胞，并使用氧电极测量耗氧量。每个条形代表平均值±S。三个实验的E**P（P）<0.01. (d日)对有或无Sirt3表达沉默的LN229细胞进行照射（16Gy）处理或未处理，并通过JC-1染色的流式细胞术分析测定线粒体膜电位。每个条形代表平均值±S。三个实验的E*P（P）<0.05, **P（P）<0.01. (e（电子）)对有或无Sirt3表达沉默的LN229细胞进行照射（16Gy）处理或未处理，用DCF-DA染色测定ROS水平，并用流式细胞仪进行分析。每个条形代表平均值±S。三个实验的E*P（P）<0.05, **P（P）<0.01
图6
图6
受照射肿瘤细胞中Sirt3基因敲除引起的凋亡增强可以通过OGG1的强制表达来阻断。(一和b条)用32Gy治疗或不治疗Sirt3表达沉默的LN229或T98G细胞γ-辐照。细胞凋亡通过：（1）裂解PARP的蛋白质印迹检测。Tubulin被用作负荷控制（左侧面板）。（2） Annexin染色的流式细胞术分析（右侧面板）。每个条形代表平均值±S。三个实验的E**P（P）<0.01. (c（c）)用OGG1表达质粒或对照质粒转染Sirt3表达沉默或未沉默的LN229细胞，然后用32Gy处理γ-辐照。通过Annexin染色的流式细胞术分析测定细胞凋亡。每个条形代表平均值±S。三个实验的E**P（P）<0.01
图7
图7
Sirt3的表达水平与肿瘤细胞增殖和形成集落的能力相关。(一)Western blot分析表达Sirt3靶向shRNA的LN229细胞中Sirt3的表达。以Tubulin作为负荷对照。(b条)表达不同水平Sirt3的LN229细胞的生长曲线。(c（c）)将表达不同水平Sirt3的LN229细胞接种在96-well板中，并使用BrdUrd掺入分析试剂盒测定增殖情况。(d日)将LN229野生型和Sirt3敲除细胞置于六孔板中，并在37°C下孵育2周。对细胞进行染色，并在光学显微镜下对菌落进行计数。#表示克隆号
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