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.2013年8月16日；113(5):495-504.
doi:10.1161/CIRCRESAHA.113.01792。 Epub 2013年7月12日。

内皮在血管钙化中的作用

姚玉成 1, 梅德特·朱马贝, 阿尔伯特·李, 梅利娜·拉德帕瓦尔, 马克·R·库伯利, 克里斯蒂娜·博斯特罗姆
附属公司

内皮在血管钙化中的作用

姚玉成等人。 循环研究. .

摘要

理论基础：血管钙化是一个涉及骨祖细胞的调节过程，经常使常见血管疾病复杂化，如动脉粥样硬化和糖尿病血管病。然而，目前尚不清楚血管内皮细胞是否在钙化病变的骨祖细胞中起作用。

目标：确定血管内皮是否有助于骨祖细胞促进血管钙化。

方法和结果：在本研究中，我们使用了2种血管钙化小鼠模型、一种骨形态发生蛋白（BMP）抑制剂基质Gla蛋白基因缺失小鼠和一种糖尿病模型Ins2Akita/+小鼠。我们发现，两种小鼠中增强的BMP信号刺激血管内皮细胞，使骨祖细胞参与血管钙化。增强的BMP信号导致内皮-间充质转变和多能干细胞的出现，然后是骨诱导。通过免疫染色和荧光激活细胞分选，内皮标记物与钙化动脉中的多潜能和成骨标记物共定位。使用Tie2-Gfp转基因小鼠的血统追踪支持成骨细胞的内皮起源。Mgp转基因介导的Ins2Akita/+小鼠基质Gla蛋白表达增强限制了多能干细胞的生成。此外，基质Gla蛋白缺失的人主动脉内皮细胞在体外获得了多能性，使其易受BMP和高糖诱导成骨的影响。

结论：我们的数据表明，内皮细胞是血管钙化中骨祖细胞的来源，血管钙化发生在BMP高活化的疾病中，如BMP抑制剂缺乏和糖尿病。

关键词：骨形态发生蛋白；内皮；基质Gla蛋白；祖细胞；血管钙化。

PubMed免责声明

数字

图1
图1。内皮细胞参与Mgp主动脉钙化−/−老鼠
（A） 主动脉壁（共聚焦显微镜，前2张图）和野生型主动脉内皮（）(管理层+/+)和管理层−/−老鼠。DIC：差分干涉对比度。EM：电子显微镜。EM放大倍数3.7×10三（B）主动脉内皮标志物CD31、VE-cadherin（VE-cad）、Flk-1和vWF在管理层+/+和管理层−/−通过实时PCR、免疫印迹和免疫染色测定小鼠。***，p<0.001。（C） 主动脉组织的免疫染色管理层+/+和管理层−/−在小鼠体内，内皮标记物CD31（顶部）和vWF（底部）以及成骨标记物Cbfa1和Osterix（OSX）共同表达管理层−/−老鼠。（D） CD31和Cbfa1在酶分散的CD45阴性主动脉细胞中的共表达管理层+/+和管理层−/−FACS测定的小鼠。（E） 共表达CD31和Osterix的细胞已渗透到管理层−/−主动脉。（F） 主动脉组织中GFP的可视化（顶部）和抗GFP抗体的免疫染色（底部）第2级-Gfptg和管理层−/−;第2级-Gfptg小鼠。（G） 主动脉组织的免疫染色第2级-Gfptg和管理层−/−;第2级-Gfptg小鼠在Mgp中表现出GFP与Cbfa1和OSX的共同表达−/−;第2级-Gfptg小鼠。比例尺，100μm。DAPI（蓝色）用于显示细胞核。非特异性IgG对照未显示染色。除非另有说明，否则照片中的血管管腔朝上。
图2
图2。Mgp中的多功能标记表达−/−和Mgp−/−;Tie2-Gfptg内皮
（A） Sox2、Nanog和Oct3/4在主动脉中的表达管理层+/+和管理层−/−通过免疫印迹（左）和免疫染色（右）检测小鼠。以β-actin为对照。（B） Sox2、Nanog和Oct3/4在主动脉中的表达第2级-Gfptg和管理层−/−;第2级-Gfp通过免疫印迹（左）和免疫染色（右）测定tg小鼠。以β-actin为对照。（C） CD31和Sox2在酶分散的CD45阴性主动脉细胞中的共表达管理层+/+和管理层−/−FACS测定的小鼠。比例尺，50μm。非特异性IgG对照未显示染色。照片中血管管腔朝上。
图3
图3。Mgp中主动脉变化的时间进程−/−小鼠主动脉
（A） 在出生后第2-30天（P）从管理层+/+和管理层−/−小鼠，并用H&E染色。（B）管理层+/+和管理层−/−MGP、BMP4、EC标记物VE-cadherin（VE-cad）和CD31的主动脉（P2-30）、成骨标记物Cbfa1和Osterix（OSX）以及多能标记物Nanog、Sox2和Oct3/4。将表达与P2上的表达进行比较。比例尺，100μm。
图4
图4。Mgp中主动脉变化的时间进程−/−小鼠主动脉
（A–C）在出生后第2-30天从管理层+/+和管理层−/−小鼠如图所示。对它们进行免疫染色（A）CD31，（B）CD31和Sox2共染色，（C）CD31与Osterix（OSX）共染色。DAPI（蓝色）用于显示细胞核。比例尺，100μm。DAPI（蓝色）用于显示细胞核。在照片中，血管管腔朝上或向右。
图5
图5。内皮细胞参与Ins2主动脉钙化秋田/+老鼠
（A） 内皮标记物CD31和vWF在主动脉中的表达2英寸秋田/+通过免疫染色观察小鼠。（B） 野生型（WT）和2英寸秋田/+小鼠显示内皮标志物CD31（左）和vWF（右）以及成骨标志物Cbfa1和Osterix（OSX）在2英寸秋田/+老鼠。（C） CD31和Cbfa1在WT和WT酶分散主动脉细胞中的共表达2英寸秋田/+老鼠，由FACS确定。（D） GFP在主动脉中的表达第2级-Gfptg和2英寸秋田/+;铁2 Gfp用抗GFP抗体对tg小鼠进行免疫染色。（E） 主动脉组织的免疫染色第2级-Gfptg和2英寸秋田/+;铁2 Gfp在tg小鼠中，GFP与Cbfa1和OSX共同表达2英寸秋田/+;第2级-Gfptg小鼠。比例尺，100μm。DAPI（蓝色）用于显示细胞核。非特异性IgG对照未显示染色。照片中血管管腔朝上。
图6
图6。糖尿病患者主动脉中多能干细胞的内皮起源秋田/+老鼠
（A） 野生型（WT）中Sox2、Nanog和Oct3/4的主动脉表达，2英寸秋田/+,2英寸秋田/+;第2级-Gfptg和2英寸秋田/+;第2级-Gfptg小鼠。以β-actin为对照。（B） CD31与Sox2、Nanog和Oct3/4在大鼠主动脉中的共表达2英寸秋田/+免疫组化检测小鼠。（C） GFP与Sox2、Nanog和Oct3/4在大鼠主动脉中的共表达第2级-Gfptg和2英寸秋田/+;第2级-Gfp免疫组化检测tg小鼠。（D） CD31和Sox2在来自WT和WT的酶分散CD45阴性主动脉细胞中的共表达2英寸秋田/+老鼠，由FACS确定。（E–G）MGP表达增强限制了Sox2、Nanog和Oct3/4在主动脉中的表达2英寸秋田/+通过（E）实时PCR、（F）免疫印迹（以β-actin为对照）和（G）WT免疫染色测定小鼠，管理层热重/重量,2英寸秋田/+，以及2英寸秋田/+;管理层热重/重量老鼠。比例尺，50μm。DAPI（蓝色）用于显示细胞核。照片中血管管腔朝上。
图7
图7。MGP的耗尽使人主动脉内皮细胞（HAEC）具有多能性和骨诱导性
（A） 转染干扰对照siRNA（SCR）或仅转染MGP siRNA（1、2道）、BMP4治疗的siRNA转染（3、4道）、Noggin治疗的siRNA转染（5、6道）或BMP4和Noggin处理的siRNA转染（7、8道）后，HAEC中多能标记物Sox2、Nanog和Oct3/4的表达，通过免疫印迹法测定。（B） 通过FACS分析确定，在不进行额外处理（左）和BMP4处理（右）的情况下转染干扰对照siRNA或MGP siRNA后，CD31和SSEA-3或CD31和SSEA-4的共表达。（C） 多潜能标记物Sox2、Nanog和Oct3/4、成骨标记物Cbfa1、Osterix（OSX）、早期SMC标记物SM22α、α-SM肌动蛋白（αSMA）和晚期SMC标记物质SM-myosin重链（SM-MHC）（顶部）的表达，转染对照siRNA或MGP siRNA，并用对照（C）、BMP2（B）、成骨介质（O）或两者（B+O）处理，通过免疫印迹法测定。（D） 如（c）所述处理的HAECS中碱性磷酸酶（ALP）和矿物质染色（茜素红和Von Kossa染色）。（E） 通过免疫印迹法测定，在干扰对照siRNA或MGP siRNA转染并用对照（C）、BMP2（B）、高糖培养基（G）或两者（B+G）处理后，多能标记物Sox2、Nanog和Oct3/4、成骨标记物Cbfa1、OSX、SM22α、αSMA和SM-MHC（top）的表达。（F） 按（E）所述处理的HAECS中碱性磷酸酶和矿物质的染色。
图8
图8。MGP缺失人主动脉内皮细胞的骨诱导作用不依赖于SM22α的表达
（A） （上图）主动脉组织的免疫染色管理层+/+和管理层−/−小鼠内皮细胞标记物CD31和早期SMC标记物SM22α和αSMA在管理层−/−老鼠。（底部）野生型（WT）和2英寸秋田/+小鼠CD31与SM22α和αSMA在2英寸秋田/+老鼠。比例尺，100μm。（B） HAEC通过干扰控制siRNA（SCR）（lane1）或Mgp siRNA与乙醚SCR（lane 2）、Cbfa1 siRNA（lane 3）或SM22a siRNA（plane 4）转染。通过免疫印迹法测定Cbfa1、Osterix（OSX）、SM22α、α-SM肌动蛋白（αSMA）和SM肌球蛋白重链（SM-MHC）的表达。以β-actin为对照。比例尺，100μm。DAPI（蓝色）用于显示细胞核。照片中血管管腔朝上。
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