Mutations in the cytoplasmic domain of the Newcastle disease virus fusion protein confer hyperfusogenic phenotypes modulating viral replication and pathogenicity

doi:10.1128/JVI.01446-13

.2013年9月；87(18):10083-93.

doi:10.1128/JVI.01446-13。 Epub 2013年7月10日。

新城疫病毒融合蛋白细胞质域的突变赋予了调节病毒复制和致病性的高融合表型

甜美的萨马尔¹, 苏尼尔·卡塔尔, 安南·帕尔杜赖, Senthilkumar Palaniyandi公司, 朱晓平, 彼得·柯林斯, 锡巴K萨马尔

附属公司

PMID： 23843643
预防性维修识别码：项目经理3754023
内政部： 10.1128/JVI.01446-13

新城疫病毒融合蛋白细胞质域的突变赋予了调节病毒复制和致病性的高融合表型

甜美的萨马尔等。 J维罗尔. 2013年9月.

.2013年9月；87(18):10083-93.

doi:10.1128/JVI.01446-13。 Epub 2013年7月10日。

作者

甜美的萨马尔¹, 苏尼尔·卡塔尔, 安南·帕尔杜赖, Senthilkumar Palaniyandi公司, 朱晓平, 彼得·柯林斯, 锡巴K萨马尔

附属

¹美国马里兰州大学弗吉尼亚-马里兰地区兽医学院。

PMID： 23843643
预防性维修识别码：项目经理3754023
内政部： 10.1128/JVI.01446-13

勘误表in

修正Samal等人，“新城疫病毒融合蛋白细胞质域的突变证实了调节病毒复制和致病性的高融合表型”。
Samal S、Khattar SK、Paldurai A、Palaniyandi S、Zhu X、Collins PL、Samal SK。 Samal S等人。《维罗尔杂志》。2020年2月28日；94（6）：e01857-19。doi:10.1128/JVI.01857-19。2020年2月28日印刷。《维罗尔杂志》。2020 PMID：32111809 免费PMC文章。没有可用的摘要。

摘要

新城疫病毒（NDV）融合蛋白（F）介导病毒与宿主细胞膜的融合，是NDV致病性的主要决定因素。在本研究中，我们证明了F细胞质尾部（CT）氨基酸的功能特性对病毒复制和发病机制的影响。在CT中的一系列C端缺失中，我们能够拯救缺乏两个或四个残基（rΔ2和rΔ4）的突变病毒。我们进一步拯救了在这四个末端残基（rM553A、rK552A、rT551A和rT550A）中每一个都有单独氨基酸替换的病毒突变体。此外，NDV F CT具有两个保守的酪氨酸残基（Y524和Y527）和一个二亮氨酸基序（LL536-537）。在其他副粘病毒中，这些残基被证明影响融合活性，并且是基底外侧靶向的中心元素。2和4个CT氨基酸的缺失和单一酪氨酸替代导致了高融合表型，并增加了病毒复制和发病机制。我们进一步发现，在rY524A和rY527A病毒中，靶向信号的破坏并没有降低极化Madin-Darby犬肾细胞顶端或基底外侧表面的表达，而在双酪氨酸突变体中，它在顶端和基底外侧表面都减少了。有趣的是，在rL536A和rL537A突变体中，F蛋白在顶端的表达多于在基底外侧表面的表达，而这种影响在rL577A突变型中更为明显。我们得出结论，NDV F CT中的这些野生型残基对调节F蛋白的生物功能有作用，从而调节病毒复制和发病机制。

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数字

图1
NDV F蛋白和引入CT的突变的示意图。显示了NDV F蛋白质和完整WT CT序列以及进行性缺失突变（Δ）的线性图。灰盒：重着色，融合肽；中间遮荫，七重复（HR）；遮光，跨膜（TM）域。丙氨酸替换用粗体表示。

图2
Vero细胞中表达的F CT突变体的Western blot分析。Vero细胞以0.01 PFU的MOI感染病毒。24 hpi后，收集并处理细胞以制备细胞裂解物。样品变性、还原，并使用抗F抗体进行Western blot分析_细胞周期特异性抗体。F的位置₀和F₁由左边距中的箭头指示。使用剥离缓冲液剥离免疫印迹，然后使用抗β-微管蛋白单克隆抗体作为细胞对照再次进行免疫染色。

图3
Vero细胞中rWT和CT突变病毒的融合性和CPE的比较。显示了与rWT相比，CT突变体获得的融合的相对水平。Vero细胞以0.1的MOI感染指示的病毒，固定在24 hpi，并用苏木精-伊红染色。融合指数计算为多核细胞中的细胞核总数与场中细胞核总数的比值。每个条件计算十个字段。融合水平标准化为100%的WT。所示数据是三个独立实验的平均值。误差条是指平均值的标准误差（SEM）(*P（P）*<0.0001，反映了通过方差分析对所有组的比较）。

图4
比较rWT和CT突变病毒在DF1细胞中的多周期生长动力学和CPE。（A） rWT、r△2、r△4、rM553A、rK552A、rT551A和rT550A的多周期生长动力学比较。细胞以0.01的MOI感染每种病毒，细胞培养基上清液等分液每隔8小时采集一次，直到64 hpi。通过DF1细胞中的斑块试验测定等分样品中的病毒滴度(*P（P）*=0.0001）。（B） rWT、rY524A、rY5.27A、rYY524-527AA、rL536A和rL537A的多周期生长动力学比较。所示数据是三个独立实验的平均值，带有标准误差(*P（P）*= 0.002).

图5
极化MDCK细胞中野生型或突变型F-CT糖蛋白的表面选择性生物素化。MDCK细胞生长在渗透性滤膜支架上，并在0.01 PFU的MOI下感染病毒。48 hpi后，细胞从顶端（Ap）或基底外侧（Bl）表面生物素化。细胞裂解后，用F特异性抗体免疫沉淀蛋白质，并用过氧化物酶偶联链霉亲和素进行SDS-PAGE分析。（A）与rWT相比，rY524A、rY527A和rYY524-527AA的细胞裂解物。（B）与rWT相比，rL536A和rL537A的细胞裂解物。

图6
极化MDCK细胞中野生型和单一酪氨酸突变F蛋白的表面分布。MDCK细胞在滤膜支架上生长，直到达到完全极化，然后感染野生型或单个酪氨酸突变体。（A）在48 hpi时，用2%PFA固定细胞，然后用抗F特异性抗血清和Alexa Fluor 555结合二级抗体染色。在用甲醇-丙酮渗透后，用抗E钙粘蛋白单克隆抗体和Alexa Fluor 488-共轭二级抗体观察细胞连接，并与DAPI共染色。（B）共焦水平切片通过细胞单层的顶部到底部，显示野生型F蛋白（i）和rY527A F蛋白（ii）在顶部和基底外侧的表面分布。

图7
将F蛋白并入病毒颗粒。（A）通过电泳分离感染尿囊液样本中的超速离心纯化病毒，然后用考马斯亮蓝对凝胶进行染色。车道：1，rWT；2，rΔ2；3，rΔ4；4，rY524A；5，rY527A。（B）使用抗Fcyt抗体（顶部）和抗NP多克隆抗体（底部）对纯化的病毒样本进行Western blotting分析。（C）通过密度测定法测量野生型和突变型病毒中NP和F蛋白的相对强度。*，*P（P）*rY524A和rY527A小于0.05。

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1. 萨马尔SK.2011。新城疫和相关禽副粘病毒，第69–114页，萨马尔SK.（ed），副粘病毒生物学。英国诺福克凯斯特学术出版社
1. Aldous EW，Alexander DJ，2001年。新城疫病毒（禽副粘病毒1型）的检测与鉴别。鸟类病理学。30:117–128-公共医学
1. Lamb RA，Kolakofsky D.2001年。副粘病毒科：病毒及其复制，p1305-1340 In Knipe DM，Howley PM（编辑），Fields病毒学。宾夕法尼亚州费城Lippincott Williams&Wilkins
1. Chen L、Gorman JJ、McKimm-Breschkin J、Lawrence LJ、Tulloch PA、Smith BJ、Colman PM、Lawr伦斯MC，2001年。新城疫病毒融合糖蛋白的结构为膜融合的分子机制提供了新的范例。结构9:255–266-公共医学

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