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临床试验
。2013;9（6）：e1003481。
doi:10.1371/journal.ppat.1003481。 Epub 2013年6月27日。

宿主因子SAMHD1限制非分裂髓系细胞中的DNA病毒

约瑟夫·奥伦堡 1, 彼得·吉, 乔纳森·贝克, 米歇尔·戴利, 莎拉·M·阿米, 杰西卡·泰特, 夏目加赛, Yuka Kanemura村, 金东云（Dong Hyun Kim）, 布莱恩·M·沃德, 小柳吉雄, 贝克·金
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临床试验

宿主因子SAMHD1限制非分裂髓系细胞中的DNA病毒

约瑟夫·奥伦堡等。 公共科学图书馆-病理学。 2013。

摘要

SAMHD1是一种新发现的抗HIV宿主因子，具有dNTP三磷酸水解酶活性，并耗尽非分裂髓系细胞中的细胞内dNTP池。由于DNA病毒利用细胞dNTP，我们研究SAMHD1是否限制DNA病毒在非分裂髓系靶细胞中的复制。事实上，两种双链DNA病毒，痘苗病毒和1型单纯疱疹病毒，在非分裂靶细胞中以dNTP依赖的方式受到SAMHD1限制。使用胸苷激酶缺陷型痘苗病毒株，我们证明在表达SAMHD1的非分裂细胞中病毒复制受到更大的限制。因此，这项研究表明，SAMHD1是一种潜在的先天性抗病毒因子，可抑制感染非分裂髓系细胞的多种DNA病毒以及逆转录病毒的复制。

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图1
图1。MDM中的疫苗复制。
（A） 在感染表达病毒核心蛋白A4与YFP融合的痘苗病毒的Western Reserve（WR）染色之前，用VLPs：Vpx+和Vpx−预处理人类原代单核细胞衍生巨噬细胞（MDM）24小时。一个典型的FACS斑点杂交显示了24 hpi时感染MDM的百分比。（B） 绘制了三个独立供体的平均值，并显示为不同VLP治疗组YFP+MDM的百分比。（C） 如实验程序所述，测定了三名捐赠者的菌斑形成单位（PFU）。显示Vpx+VLP和Vpx−VLP组之间的折叠变化。
图2
图2。MDM中WRΔTK复制的分析。
（A） MDM用Vpx+或Vpx−VLP预处理24小时，然后感染胸腺嘧啶激酶缺陷型痘苗病毒，该病毒表达与GFP融合的晚期病毒F13蛋白（WRΔTK）。（A） 使用FACS测定三个独立供体的GFP+MDM百分比，并绘制Vpx+VLP和Vpx−VLP处理之间的倍数变化。（B） 三名独立捐赠者的平均值用图表表示，显示了不同VLP治疗组GFP+MDM的百分比。（C） 测定并绘制了感染WRΔTK病毒的三名供体的PFU。将Vpx+VLP组与Vpx−VLP组的折叠变化进行比较。
图3
图3。SAMHD1在疫苗感染MDM中的表达。
（A） 用Vpx+或Vpx−VLP治疗的MDM感染了WR或WRΔTK病毒（NI：无感染）（1个PFU/细胞）。产生24 hpi的细胞裂解物，并使用α-SAMHD1、α-actin或α-GFP抗体进行Western blot分析。（A） 显示了一位捐赠者的代表性免疫印迹。对三名独立供体的SAMHD1（B）和GFP（C）免疫印迹进行定量。将数据归一化为肌动蛋白信号量，并绘制SAMHD1 NI车道（设置为1.0）和GFP Vpx−VLP车道（设置成1.0）的信号量。
图4
图4。HIV-1 RT引物延伸分析监测dNTP水平。
（A） 使用dNTP分析法分析MDM样品提取物。5′32P末端标记的引物（“P”）分别退火到四个不同模板中的一个。核苷酸延伸产物的摩尔量（“P+1”）等于提取样品中包含的每个dNTP的摩尔量，这允许我们计算和比较不同处理的dNTP浓度。显示了三种MDM捐赠者中的一种在不同条件下监测dNTPs水平的代表性凝胶。车道键指示每条车道使用的不同处理条件。（B） 原始数据的定量绘制为每个dNTP浓度的条形图。绘制了不同MDMs治疗组之间dNTP的倍数变化。
图5
图5。SAMHD1抑制HSV复制。
（A） 对从PMA刺激的THP-1 shControl和shSAMHD1细胞获得的裂解物进行Western blot分析，这些细胞感染了HSV-1 KOS的不同MOI，以确定SAMHD1-、HSV-1病毒蛋白UL-27和ICP4（用星号表示）的水平，以及微管蛋白负荷对照。（B） 进行实时PCR以测定HSV-1 KOS感染后PMA刺激的shControl（实线）和shSAMHD1（虚线）THP-1细胞中HSV-1 DNA水平，MOI为0.01，持续72小时。（C）测量MOI为0.01THP-1感染细胞的PFU。（D） 实时PCR检测感染MOI为0.1的THP-1细胞的HSV-1 DNA水平。（E） 测量MOI为0.1时感染THP-1细胞的PFU。（F） HSV-1感染PMA刺激的shControl和shSAMHD1 THP-1细胞后，在有或无20µM更昔洛韦的情况下测定HSV-1 DNA水平。结果代表了两个独立的重复实验。
图6
图6。Vpx介导的SAMHD1下调增加了THP-1细胞HSV-1 KOS感染。
（A和B）shControl和shSAMHD1 THP-1细胞在非分裂或分裂条件下以0.1的MOI感染HSV-1（KOS）48小时。这些结果是重复进行的三个独立实验的代表性数据。（A） HSV-1 DNA拷贝数通过实时PCR进行分析，（B）细胞中dATP水平通过HIV-1 RT引物延伸试验进行测定，如图4所示。（C） 用含有载体Vpx-VLP或Vpx+VLP的培养基接种PMA刺激的shControl和shSAMHD1 THP-1细胞24 h，并以0.1的MOI感染HSV-1 WT病毒。产生48 hpi的细胞裂解物，并通过蛋白质印迹分析测定SAMHD1和微管蛋白的蛋白质水平。这些结果代表了三个独立的重复实验。（D） 实时PCR用于监测HSV-1 DNA水平。（E） 测量不同VLP治疗组shControl和shSAMHD1 THP-1细胞的PFU。测定并显示不同组之间的折叠变化。
图7
图7。SAMHD1增加了人类原发性DC和MDM中HSV-1的感染。
用含有载体Vpx−VLP或Vpx+VLP的培养基接种初级成熟树突状细胞48小时，然后以0.1的MOI感染HSV-1 KOS。在48 hpi时产生细胞裂解物，并对SAMHD1和微管蛋白进行（A）western blot分析。（B） 实时PCR检测HSV-1 DNA水平为48 hpi。（C） 在感染HSV-1 F株（0.5 PFU/细胞）之前，用VLP预处理原始人类MDM。通过FACS分析监测病毒gB蛋白的细胞内染色，数据以gB阳性MDM的百分比表示。
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