Induction of apoptosis in MCF-7 cells by the hemagglutinin-neuraminidase glycoprotein of Newcastle disease virus Malaysian strain AF2240

doi:10.3892/or.2013.2573

.2013年9月；30(3):1035-44.

doi:10.3892/或.2013.2573。 Epub 2013年6月27日。

新城疫病毒马来西亚株AF2240血凝素-神经氨酸酶糖蛋白诱导MCF-7细胞凋亡

穆罕默德·格里奇¹, 穆罕默德·埃尔·佐瓦拉蒂, 阿卜杜勒·拉赫曼·奥马尔, 艾尼偶像

附属公司

PMID： 23807159
预防性维修识别码： PMC3783058型
DOI（操作界面）： 10.3892/或.2013.2573

新城疫病毒马来西亚株AF2240血凝素-神经氨酸酶糖蛋白诱导MCF-7细胞凋亡

穆罕默德·格里奇等。及国际医学权威期刊. 2013年9月.

.2013年9月；30(3):1035-44.

doi:10.3892/或.2013.2573。 Epub 2013年6月27日。

作者

穆罕默德·格里奇¹, 穆罕默德·埃尔·佐瓦拉蒂, 阿卜杜勒·拉赫曼·奥马尔, 艾尼偶像

附属

¹马来西亚普特拉大学兽医学院兽医病理学和微生物学系，地址：43400 UPM Serdang，Selangor Darul Ehsan，Malaysia。

PMID： 23807159
预防性维修识别码： PMC3783058型
DOI（操作界面）： 10.3892/或.2013.2573

摘要

新城疫病毒（NDV）可能通过诱导细胞凋亡来发挥其自然发生的溶瘤作用。我们假设，病毒通过血凝集素-神经氨酸酶（HN）糖蛋白与细胞结合，可能不仅足以诱导细胞凋亡，而且诱导比亲本NDV AF2240病毒更高的细胞凋亡水平。对NDV AF2240诱导MCF-7人乳腺癌细胞凋亡进行分析和定量。此外，对NDV AF2240株HN基因进行了扩增、测序并克隆到pDisplay真核表达载体中。HN基因首次在转染MCF-7细胞的细胞表面膜上检测到表达。分析并量化HN对转染MCF-7细胞凋亡的诱导作用。单独表达HN基因能够诱导MCF-7细胞凋亡，但与亲本NDV AF2240株相比，它是一种较弱的凋亡诱导剂。总之，NDV AF2240株是一种比其重组HN基因更合适的抗肿瘤候选药物，除非后者通过额外修饰得到进一步改进。

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图1
新城疫病毒AF2240诱导MCF-7细胞凋亡具有剂量依赖性。（A）图像显示在未感染的MCF-7细胞中发现少量生理性凋亡。用不同滴度的病毒株感染MCF-7细胞，并将细胞在5%的CO中培养48小时₂大气。孵育结束时，用流式细胞仪检测NDV AF2240株诱导的细胞凋亡率，发现感染NDV AF2440（B）的50个血凝单位（HAUs）的细胞有39%的凋亡，感染100个HAUs的细胞有46%的凋亡。（D） NDV AF2240株250株HAU感染可诱导62.75%的细胞凋亡。

图2
新城疫病毒（NDV）株AF2240滴度增加对MCF-7细胞凋亡百分比的影响。用不同浓度的NDV感染MCF-7细胞并孵育48 h。结果表示为流式细胞术直接评估的凋亡细胞的平均百分比。每个值代表三份培养物的平均值±标准偏差。误差条表示平均值的标准偏差。使用平均值的1个标准偏差构建每个误差条。

图3
线粒体通透性转换孔开放检测。用新城疫病毒AF2240株250个血凝单位（HAU）感染MCF-7细胞。在37ºC和5%CO中孵育1小时后₂将模拟细胞和感染细胞用改良的HBSS缓冲液冲洗两次，然后用含有丝裂原追踪红CMXROS的溶液进行标记，并在37ºC和5%CO中培养15分钟₂大气。最后，冲洗细胞并在荧光显微镜下观察。（B） MCF-7感染细胞显示红色和黄色荧光，这是线粒体通透性转换孔开放激活的典型特征。（A）后者在未感染的MCF-7细胞中未被激活，这些细胞以彗星的形式在细胞质中保持绿色荧光。（A）核被Hoechst染成蓝色。

图4
新城疫病毒AF2240株HN基因的RT-PCR琼脂糖凝胶电泳扩增。扩增的HN基因大小约为1.8 kb，在琼脂糖凝胶上进行分离，并用溴化乙锭染色（第2道），而从未感染的MCF-7细胞（第1道）提取的总RNA扩增为阴性。泳道M代表1kb的DNA阶梯（Promega Corporation，Madison，WI，USA）。

图5
阳性重组pCR 2.1/HN和pDisplay表达载体的琼脂糖凝胶电泳。阳性重组pCR 2.1/HN和pDisplay载体均用限制性内切酶双重消化萨尔我和萨克II从pCR 2.1载体（通道2）中释放血凝素-神经氨酸酶（HN）片段。双消化pDisplay矢量以5.3 kb的大小进行分馏（通道1）。Lane M代表1 kb DNA阶梯（美国威斯康星州麦迪逊市Promega Corporation）。

图6
琼脂糖凝胶电泳将血凝素-神经氨酸酶（HN）基因克隆到pDisplay表达载体中。通过使用限制性内切酶的双重消化来分析阳性重组pDisplay/HN萨尔我和萨克II释放了大小为1.8 kb的HN基因（通道2）。pDisplay载体也被两种酶双重消化（通道1）。Lane M代表1 kb DNA阶梯（美国威斯康星州麦迪逊市Promega Corporation）。

图7
重组血凝素-神经氨酸酶（HN）在MCF-7细胞表面的表达。用1.2μg重组pDisplay/HN转染MCF-7细胞。（B）转染后48小时，用间接免疫荧光法分析转染MCF-7细胞的HN表达及其在细胞表面膜上的特异性定位（箭头）。

图8
重组血凝素-神经氨酸酶（HN）表达诱导转染MCF-7细胞凋亡。转染1.2μg重组pDisplay/HN的MCF-7细胞在培养48小时后用流式细胞仪进行分析。HN在MCF-7细胞中的表达诱导了45%的凋亡（B），而非转染MCF-7的细胞则诱导了6.5%的正常生理性死亡（A）。直方图中的标记R2表示凋亡细胞的百分比。实验重复三次。

图9
重组血凝素-神经氨酸酶（HN）基因诱导MCF-7细胞凋亡。用不同数量的pDisplay/HN重组物转染MCF-7细胞，转染后48小时用流式细胞仪对细胞进行分析。细胞凋亡诱导呈剂量依赖性。MCF-7细胞也仅用LTX试剂和pDisplay载体转染。NTC，非转染MCF-7细胞。LTX，脂多糖胺^®LTX转染试剂。VEC，仅用载体转染。rHN，重组pDisplay/HN。每个条形代表3个独立实验的结果。误差线表示偏差标准。

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[4] 肖邦·PW，Compans RW。副粘病毒的繁殖。收件人：Fraenkel-Conrat H，Wagner RR，编辑。综合病毒学。第4卷。增压器；纽约：1975年。第95-178页。

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[9] 亚历山大DJ。纽卡斯尔病。英国保尔特科学。2001;42:5–22.-公共医学

[10] 亚历山大DJ。纽卡斯尔病。英国保尔特科学。2001;42:5–22.-公共医学

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