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.2013年9月；23(9):1446-61.
doi:10.1101/gr.152942.112。 Epub 2013年6月24日。

CCAT2是一种新的非编码RNA，定位于8q24，是结肠癌转移进展和染色体不稳定性的基础

慧玲 1, 里卡多·斯皮佐, 亚瑟·阿特拉西, 米莲娜·尼科洛索, 清水Masayoshi Shimizu, Roxana S Redis公司, 西田直弘, 罗伯塔·加法, 宋健, 郭志毅, 克里斯蒂娜·伊凡, 伊丽莎·巴巴罗托, 英格丽德·弗里斯, 张新娜（Xinna Zhang）, 曼纽拉·费拉辛, 迈克·丘奇曼, Janneke F van Galen公司, 伯纳·H·贝弗卢, 玛丽亚姆·沙里亚蒂, 弗兰齐斯卡·哈德克, 马科斯·埃斯特西奥, 吉列尔莫·加西亚·马内罗, Gijs A Patijn先生, 大卫·高特利, 维卡斯·巴德瓦吉, 伊马德·舒雷奇, Subrata Sen公司, 阿莎·S·穆尔塔尼, 詹姆斯·沃尔什, 肯·山本, 谷口伊铃木, 民歌, 史蒂文·加林格, 格雷厄姆·凯西, 斯蒂芬·西博多, 洛伊克·勒马尔坎德, Maarit Tiirikainen公司, 森杜赖A Mani, 张伟（音译）, 拉马纳五世（Ramana V Davuluri）, Koshi Mimori公司, Masaki Mori先生, Anieta M Sieuwerts公司, 约翰·W·M·马滕斯, 汤姆林森, 马西莫·内格里尼, Ioana Berindan-Neagoe公司, 约翰·福肯斯, 斯坦利·汉密尔顿, 乔瓦尼·兰扎, 斯科特·科佩兹, 里卡多·福迪, 乔治·A·卡林
附属公司

CCAT2是一种定位于8q24的新型非编码RNA，是结肠癌转移进展和染色体不稳定的基础

慧玲等。 基因组研究. 2013年9月.

摘要

8q24基因沙漠中SNP在癌症表型中的功能作用尚不清楚。在这里，我们报道了CCAT2，一种新的长非编码RNA转录物（lncRNA），包含rs6983267 SNP，在微卫星稳定的结直肠癌中高度过度表达，并促进肿瘤生长、转移和染色体不稳定。我们证明，通过TCF7L2介导的转录调控，CCAT2上调了MYC、miR-17-5p和miR-20a。我们进一步确定CCAT2和TCF7L2之间的物理相互作用导致WNT信号活性增强。我们表明CCAT2本身是WNT下游目标，这表明存在反馈回路。最后，我们证明SNP状态影响CCAT2的表达，风险等位基因G产生更多CCAT2转录。我们的结果支持新的lncRNA CCAT2在结直肠癌发病机制中对MYC和WNT调节的新机制，并为SNP带来的癌症风险提供了另一种解释。

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数字

图1。
图1。
CCAT2公司，一种新的lncRNA，跨越rs6983267，在结直肠癌样本中过度表达。(A类)跨越SNP rs6983267的8q24.21区域的基因组特征和基因定位CCAT2公司。括号中的数字表示相对于rs6983267的基因组距离（图片未按比例显示）。(B类)CCAT2型CRC患者样本中的表达。CCAT2型用qRT-PCR定量表达，数据以盒子-嘶嘶作图的形式呈现，显示了五种统计数据(降低晶须至少为5%，降低方框部分是第25个百分位，方框中的实线表示中位数，上面的盒形零件为第75个百分位，并且上面的晶须最多为95%）。(C类)原位杂交CCAT2公司和RNU6-6P系列(6号机组)（作为正常化者）在CRC患者样本中。
图2。
图2。
CCAT2公司促进肿瘤生长和转移。(A类)CCAT2公司小鼠异种移植模型皮下肿瘤形成增加。将空向量与CCAT2公司使用t吨-测试。(B类)HCT116细胞转导CCAT2公司通过使用迁移室测量，显示出明显更高的迁移能力。数据以三个独立实验的平均值±SEM表示。(C类)击倒CCAT2公司降低KM12SM结肠癌细胞的侵袭能力。治疗后CCAT2公司siRNA（50 nM）培养24小时，将细胞接种到入侵检测室中48小时，并对入侵细胞进行染色和计数。(D类)CCAT2公司增强通过脾内注射HCT116细胞孵育的小鼠的肝转移。肝转移的代表性图像CCAT2公司显示组。(E类)CCAT2公司转移患者（M1）的意大利原发性CRC样本中的表达水平高于无转移患者（M0）。使用Mann-Whitney检验进行比较。数据以盒子-发声图的形式呈现。(F类)乳腺癌患者CCAT2公司无转移生存期较短。Kaplan-Meier分析作为CCAT2公司129例接受环磷酰胺、甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶辅助联合化疗的淋巴结阳性乳腺癌患者的水平。CCAT2公司正常化水平较高，>0.0045；CCAT2公司低水平，≤0.0045。
图3。
图3。
CCAT2公司诱导HCT116细胞染色体不稳定。(A类)染色体异常增加CCAT2公司-基因组不稳定性分析确定的过表达克隆。(B类)HCT116克隆的光谱核型示例显示OC2克隆从原始二倍体（E1）到四倍体核型发生了变化。(C类,D类)CCAT2公司在一组独立的CCAT2公司-过表达克隆。计算每个克隆的染色体异常数；数据表示为平均值±SD(E类)中心体异常CCAT2公司-通过免疫染色过度表达克隆OC1和OC2。β-微管蛋白（红色）；CREST/动粒（绿色）。
图4。
图4。
的规定MYC公司表达式CCAT2型. (A类)增加CCAT2公司和MYC公司MSS CRC样本中的表达。的表达式配置文件MYC公司和CCAT2公司使用qRT-PCR对意大利CRC/对照粘膜样品进行检测。(B类)的相关性MYC公司蛋白质和CCAT2公司HCT116高、低克隆RNA水平CCAT2公司水平。(C类)CCAT2公司miRNA表达增加MIR17HG型，miR-146a表达降低，对let-7a（用作阴性对照）。(D类)下调MYC公司(上面的面板：蛋白质；降低面板：RNA）由CCAT2公司HCT116 OC2克隆中的siRNA。(E类)减少MYC公司以COLO320 sh表示CCAT2公司稳定克隆。(F类)减少MYC公司强力霉素诱导的shCCAT2公司克隆COLO320。(G公司)减少迁移CCAT2型-通过抗miR-17-5p和抗miR-20a转导HCT116细胞。在抗miR处理24小时后，将细胞接种到迁移测定室中24小时，并对迁移的细胞进行染色和计数。(*)P（P）< 0.05.
图5。
图5。
TCF7L2活性的调节CCAT2公司. (A类)CCAT2公司用qRT-PCR在分馏COLO320细胞和HCT116中鉴定的核定位CCAT2公司克隆。(B类)CCAT2公司核定位，如使用原位杂交在CRC样本中确定的。(C类)CCAT2公司增加了TCF7L2绑定到MYC公司发起人。ChIP分析显示，在CCAT2公司-过表达克隆（OC1）比基底细胞CCAT2公司表达式（E1）。山羊IgG作为对照抗体。(D类)WNT活性较高CCAT2公司稳定克隆，通过TOP-Flash报告分析鉴定。(E类)的瞬态表达式CCAT2公司诱导HEK293细胞中TOP-Flash荧光素酶活性增加两倍以上。中的数据C类和D类表示为平均值±SEM(n个= 3). (*)P（P）< 0.05. (F类)Colocalization ofCCAT2公司利用抗TCF7L2抗体在异位OC1中进行RNA免疫沉淀CCAT2公司过度表达。(G公司)Colocalization ofCCAT2公司利用抗TCF7L2的RNA免疫沉淀法在COLO320细胞中携带TCF7L2蛋白的RNA，这些细胞内源性高CCAT2型表达式。使用qRT-PCR和PCR凝胶图像进行定量分析。(H（H）)用波形蛋白抗体或DAPI对HCT116克隆进行免疫染色。上皮-间充质转化中观察到更强的波形蛋白信号CCAT2公司-过表达克隆比在具有基底细胞的细胞中过表达克隆CCAT2公司表达式。(我)CCAT2公司增加CD44细胞和VIM公司HCT116克隆中。数据以至少三个独立实验的平均值±SEM表示。(*)P（P）< 0.05.
图6。
图6。
的规定CCAT2公司WNT信号转导和SNP变异在CCAT2公司表达式。(A类)CCAT2公司氯化锂（LiCl）在三种结肠癌细胞系中诱导表达。AXIN2型或TOP-Flash荧光素酶活性作为WNT信号激活的阳性对照。数据以平均值±SD表示(n个= 3). (B类)TCF7L2对氯化锂诱导的CCAT2公司表达式。HCT116细胞用TCF7L2型siRNA（siGENOME SMARTpool TCF7L2；Dharmacon）24小时，然后用氯化锂刺激24小时。CCAT2公司用qRT-PCR测定表达水平。(C类)TCF7L2型siRNA下调CCAT2公司过表达OC2克隆中的表达，无论是否有LiCl刺激。(D类,E类)TCF7L2型siRNA（sc43525，Santa Cruz）下调CCAT2公司在KM12SM细胞和COLO320细胞中表达。数据表示为平均值±SEM(n个= 3); (*)P（P）与相应的对照组相比，<0.05。(F类)的比较CCAT2型来自意大利的GG和TT基因型CRC样本队列中的表达较高CCAT2公司与G等位基因相关的表达。这个P（P）-使用Mann-Whitney检验计算值。数据以箱-嘶嘶图的形式呈现。(G公司,H（H）)焦磷酸测序数据显示，G等位基因在CCAT2公司在异质性rs6983267细胞系（DLD1和KM12SM）和具有GT基因型的CRC患者样本中，转录物比其基因组DNA对应物高。COLO320是TT基因型，在这里用作阴性对照。
图7。
图7。
一个模型CCAT2公司CRC的基因座参与。(上部面板）～335-kb的DNA环使rs6983267基因组区域接近MYC公司位点，这种物理联系可能有助于SNP区域在MYC公司转录（Pomerantz等人，2009年）。(下部面板）增强子区域转录成长的非编码RNA(CCAT2公司)SNP状态影响CCAT2公司由as-yet-unknown机制表达。这个CCAT2公司转录物上调WNT活性并增加WNT靶基因的表达水平（包括MYC公司). 本规定由CCAT2、，可能通过其与TCF7L2的物理相互作用，导致基因组不稳定并促进细胞生长。我们证明MYC调节的miR-17-5p和miR-20a参与CCAT2公司-增强细胞侵袭并推测其他机制，如MYC相关机制(CDC25A型)或增强WNT信号(VIM公司和CD44细胞)，可能存在以协调由CCAT2公司最后，我们证明了CCAT2公司表达受转录因子TCF7L2调节，表明在CCAT2型和WNT信令。我们的研究结果对SNP导致的CRC风险提供了额外的解释。（黑色）已演示；（灰色）假设的相互作用。
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