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.2013年10月15日；22(20):2777-93.
doi:10.1089/scd.2012.0422。 Epub 2013年7月24日。

具有不同维甲酸反应性的不同神经干细胞群体中的维甲酸机制

芭芭拉·奥索利斯 1, 阿德里安·博西, 埃米利亚·马达拉斯, 索菲亚·梅萨罗斯, 蒂米亚·科希迪, 卡罗利·马克奥, 马尔塔·杰利泰, 埃尔文·韦尔克, 苏珊娜·科恩耶伊
附属公司

具有不同维甲酸反应性的不同神经干细胞群体中的维甲酸机制

芭芭拉·奥索利斯等。 干细胞开发. .

摘要

维甲酸（RA）存在于胚胎和成人大脑的神经发生部位。虽然人们普遍认为RA信号参与神经干细胞分化的调节，但对维生素A的利用和神经原生态位中活性维甲酸的生物合成，或神经干细胞和分化后代中维甲酸代谢的细节知之甚少。在这里，我们提供了不同神经干细胞/神经祖细胞群体的维甲酸反应性和RA生成的数据。此外，我们还证明了编码维甲酸机制蛋白质的基因表达的分化相关变化，包括负责维生素A摄取（Stra6）和储存（Lrat）、维甲酸转运（Rbp4、CrbpI、CrabpI-II）、合成（Rdh10、Raldh1-4）、RA降解（Cyp26a1-c1）的成分和RA信号（Rarα、β、γ、Rxrα、β和γ）。我们表明，早期胚胎神经外胚层（NE-4C）干细胞和晚期胚胎或成人衍生的放射状胶质样祖细胞（RGl细胞）都能够产生具有生物活性的维甲酸，但对维甲酸信号的反应不同。然而，虽然RA不能诱导RGl细胞的神经元分化，但NE-4C细胞的神经元形成是由RA和RA前体（视黄醇或醋酸视黄酯）共同启动的。数据表明，内源性RA的产生，至少在某些神经干细胞群体中，可能导致神经元分化的自分泌调节。

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数字

图1。
图1。
维甲酸代谢。在循环中，ROL与RBP4绑定。通过STRA6受体促进运输，细胞可以吸收它。在细胞内，ROL由CRBP携带，可以以RE的形式存储，也可以通过两步过程转换为RA。RA与CRABPs结合后被转运至细胞核，并通过激活RA受体异二聚体发挥作用。过量的RA可以被CYP26酶代谢。RE，视黄酯；RAL，视黄醛；ROL，视黄醇；RA，维甲酸；RBP4，视黄醇结合蛋白4；ROL/RBP4复合物受体STRA6；细胞ROL结合蛋白；细胞RA结合蛋白CRABP；ADH、乙醇脱氢酶；RDH、ROL脱氢酶；RALDH，视黄醛脱氢酶；视黄醇酯水解酶；卵磷脂ROL酰基转移酶；RAR、RA受体；维甲酸X受体；CYP26，细胞色素P450（CYP）酶家族。
图2。
图2。
NE-4C神经干细胞和放射状胶质样（RGl）细胞的特征。（A）诱导第7天（DIV7）的非诱导NE-4C细胞（Ø）和NE-4C衍生神经元的β−III微管蛋白免疫细胞化学染色的相控视图（bars:50μm）。NE-4C细胞的神经分化是通过去除血清（DM：定义的培养基）或RA治疗（DM+RA）启动的。（B）RT-PCR对某些发育相关基因的表达(10月4日干细胞特异性，Ngn2号机组前肢神经的，数学2神经原性/神经元性和Gfap公司非分化（Ø）或分化细胞中的星形胶质细胞特异性）基因。（C、D）与非诱导细胞（DIV0）相比，分化过程中相同基因的相对表达（DIV2–DIV14）。（E）诱导第7天（DIV7），非诱导（EGF+）成年衍生RGl细胞的特征性细长形态及其神经元和星形胶质细胞衍生物的免疫荧光染色（bars:20μm）。提取EGF（EGF-）诱导RGl细胞分化。（F）RT-PCR显示10月4日,Ngn2，数学2和Gfap公司胚胎或成年RGl细胞的基因。（G、H）与非诱导细胞（DIV0）相比，分化过程中相同基因的相对表达（EGF−；DIV4和DIV8）。DIV表示诱导开始后的体外天数。“−”和“+”代表RT-PCR反应的阴性（水）和阳性（全脑）控制。“M”表示分子量标记。所有实时PCR数据均为三份数据的平均值±SD。表皮生长因子；RT，逆转录。
图3。
图3。
通过测量F9 RA报告细胞中的β-半乳糖苷酶活性来测定NE-4C神经干细胞和RGl细胞产生的视黄醇。（A）NE-4C细胞保存在DM中或用1μM RE、ROL或RA处理48小时（DIV0-2），然后彻底清洗并在无维甲酸培养基中保存6天以上（DIV2-8）。RA-报告细胞分析在DIV8上进行，将分化的NE-4C细胞与报告细胞共培养。该方法允许直接激活转基因细胞*P（P）<0.01.（B）F9 RA-报告细胞对条件培养基的β-半乳糖苷酶反应，条件培养基取自在缺乏（DM）或存在（DM+RE）醋酸视黄酯的情况下生长至少2周的非分化（EGF+）或分化（EGF-）胚胎或成年RGl细胞，以及在试验期间。分析的光密度（OD）值（A）,B）与β-半乳糖苷酶活性有关（100%；由虚线)对照F9细胞*P（P）<0.01：与F9细胞有显著差异#P（P）<0.05：与在DM+RE中生长的细胞有显著差异。
图4。
图4。
对NE-4C神经干细胞和RGl细胞分化过程中与维生素A结合、摄取和储存有关的维甲酸机械元件进行RT和实时PCR分析。（A） 4卢比,Stra6系列、和拉特RT-PCR显示NE-4C细胞表达。NE-4C细胞的神经分化是通过血清清除（DM）或RA治疗（DM+RA）启动的。（B、C）实时PCR分析Stra6系列和拉特在NE-4C细胞中表达2周。（D、E）的RT-PCRStra6系列和拉特在RA诱导NE-4C细胞开始后的前44小时。（F–J）逆转录聚合酶链反应（F）和实时PCR（G–J）分析4卢比,Stra6系列和拉特非分化（EGF+）和分化（EGF-）胚胎中的表达（G、H）和成人（I，J）RGl细胞。DIV和Hrs分别表示诱导开始后的体外天数和小时数。“−”和“+”代表RT-PCR反应的阴性（水）和阳性（脑、肝）对照。“M”表示分子量标记。所有实时PCR数据均为三份数据的平均值±SD*P（P）<0.05;#P（P）=0.064.
图5：。
图5：。
NE-4C神经干细胞和RGl细胞分化过程中RA合成相关基因的RT和实时PCR分析。（A）的表达式10路通过RT-PCR在未分化的NE-4C细胞和分化的NE-4C细胞中都证明了这一点。通过停血清（DM）或RA治疗（DM+RA）诱导分化。（B–E）的表达式拉尔德1-4实时PCR显示NE-4C细胞分化（B–D）在前2周和通过RT-PCR检测（E）诱导开始后的前44h。（F–H）逆转录聚合酶链反应（F）和实时PCR（G、H）分析10路和拉尔德1-4非分化（EGF+）和分化（EGF-）胚胎中的表达（G）和成人（H）RGl细胞。DIV和Hrs分别表示诱导开始后的体外天数和小时数。“−”和“+”代表RT-PCR反应的阴性（水）和阳性（肝脏、胶质细胞）对照。“M”表示分子量标记。所有实时PCR数据均为三份数据的平均值±SD*P（P）<0.05;#P（P）=0.058; °P（P）=0.071.
图6。
图6。
NE-4C神经干细胞和RGl细胞中ROL和RA细胞内结合相关基因的RT-PCR分析。（A）RT-PCR分析CrbpI公司和蟹肉I-II在非分化（Ø）和分化的NE-4C细胞中。通过停血清（DM）或RA治疗（DM+RA）诱导分化。（B）RT-PCR分析CrbpI公司和蟹肉I-II在非分化（EGF+）和分化（EGF-）RGl细胞中的表达。DIV表示诱导开始后的体外天数。“−”和“+”代表RT-PCR反应的阴性（水）和阳性（肝）对照。“M”表示分子量标记。
图7。
图7。
NE-4C神经干细胞和RGl细胞RA分解代谢相关基因的RT和实时PCR分析（A–C）的表达式Cyp26a1、Cyp26b1、和Cyp26c1细胞RT-PCR证实的酶mRNA（A、C）和实时PCR（B）在未分化的NE-4C细胞和分化的NE-4C细胞中。细胞的分化是通过停血清（DM）或RA治疗（DM+RA）诱导的。（D–F）逆转录聚合酶链反应（D）和实时PCR（E，F）分析细胞周期26a1-c1非分化（EGF+）和分化（EGF-）RGl细胞中的酶表达。DIV和Hrs分别表示诱导开始后的体外天数和小时数。“−”和“+”代表RT-PCR反应的阴性（水）和阳性（肝脏、胶质细胞）对照。“M”表示分子量标记。所有实时PCR数据均为三份数据的平均值±SD*P（P）<0.05;#P（P）=0.06; °P（P）=0.097.
图8。
图8。
NE-4C神经干细胞和RGl细胞中RARs和RXRs的RT-PCR和微阵列分析。（A）的表达式Rar公司和Rxr公司通过RT-PCR在非分化（Ø）和分化的NE-4C细胞中均显示了mRNA。（B）微阵列数据显示，与未分化细胞相比，分化细胞中维甲酸受体亚单位的表达。分化要么是通过停血清（DM；A类)或在DM（DM+RA；A类)或在含有血清的培养基中（SM+RA；B类).（C）RT-PCR分析Rar公司和Rxr公司非分化（EGF+）和分化（EGF-）胚胎和成年RGl细胞中的受体表达。DIV和Hrs分别表示诱导开始后的体外天数和小时数。“−”和“+”代表RT-PCR反应的阴性（水）和阳性（肝脏、胶质细胞）对照。“M”表示分子量标记。
图9：。
图9：。
NE-4C神经干细胞和RGl细胞对类维生素A的不同反应。（A）NE-4C细胞培养物中的神经元特异性β-III微管蛋白免疫反应神经元在无维甲酸DM或补充1μM RE、ROL或RA的培养基中生长3、5、7或9天（DIV）。（B）培养物中荧光的密度分析(n个=4）表示为（A）将数据归一化为3天（100%）无维甲酸DM培养物的平均OD。（C）由1μM RE、ROL或10 nM RA诱导的培养物中的神经元百分比，以及在存在或不存在100 nM泛RAR拮抗剂AGN193109的情况下生长的不同时期（DIV开始-结束). 在β-III微管蛋白免疫染色制剂中测定神经元的百分比(n个=每个4）固定在第4天。这些数据与在维甲酸和无拮抗剂DM培养物中生长的神经元百分比有关（100%，DMØ）。DIV表示诱导开始后的体外天数*P（P）<0.05.（D）胚胎和成年RGl细胞培养物中的β-III微管蛋白免疫反应神经元在缺乏或存在不同维甲酸（1μM RE，ROL，RA）补充剂的情况下生长（EGF+）或分化（EGF-）4天。（E、F）在含有1μM RE、ROL、RA或100 nM RAR拮抗剂的培养基中培养4天的神经元百分比。在β-III微管蛋白免疫染色制剂中测定神经元的百分比(n个=每个4）固定在第4天。从对照（维甲酸和无拮抗剂）培养物中获得的数据设置为100%。比例尺：100μm。
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