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.2013年11月；58(5):1681-92.
doi:10.1002/9月26114日。 Epub 2013年9月17日。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ和乙型肝炎病毒X蛋白对肝细胞癌细胞MicroRNA-122的表观遗传调控

Kyongsub歌曲 1, 常翰, 张金强, 东东路, Srikanta短划线, 马克·费特尔森, Kyu Lim公司, 童武
附属公司

过氧化物酶体增殖物激活受体γ和乙型肝炎病毒X蛋白对肝细胞癌细胞MicroRNA-122的表观遗传调控

Kyongsub歌曲等。 肝病学. 2013年11月.

摘要

MicroRNA-122（miR-122）是一种关键的肝脏特异性miRNA，与多种肝脏疾病有关，包括肝细胞癌（HCC）和丙型肝炎和乙型肝炎病毒感染。本研究旨在探讨miR-122在人肝癌细胞中的表观遗传学调控，并检测丙型肝炎病毒（HCV）和乙型肝炎病毒（HBV）的作用。我们进行了microRNA微阵列分析，并将miR-122确定为使用5'aza-2'脱氧胞苷（5-aza-CdR，DNA甲基化抑制剂）和4-苯丁酸（PBA，组蛋白脱乙酰化抑制剂）处理的人类肝癌细胞中上调最多的miRNA（6倍）。实时聚合酶链反应（PCR）分析证实，5'aza和PBA在肝癌细胞中显著上调miR-122，在原代肝细胞中上调幅度较小。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）和视黄醇X受体α（RXRα）复合物与miR-122基因启动子中的DR1和DR2共有位点相关，后者可增强miR-122的基因转录。5-Aza-CdR和PBA处理增加了PPARγ/RXRα的相关性，但减少了其辅抑制因子（N-CoR和SMRT）与miR-122 DR1和DR2基序的相关性。上述DNA蛋白复合物还包含SUV39H1，一种H3K9组蛋白甲基转移酶，可下调miR-122的表达。

结论：这些发现确立了PPARγ结合复合体在人类肝癌细胞miR-122表观遗传调控中的新作用。此外，我们发现乙型肝炎病毒X蛋白与PPARγ结合并抑制miR-122的转录，而丙型肝炎病毒颗粒则无明显作用；这些发现为HBV患者而非HCV感染患者miR-122降低提供了机制性见解。

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不存在利益冲突

数字

图1
图1。肝癌细胞中miR-122的表达受到表观遗传抑制
（A）MiRNA表达热图描绘了用对照载体或5-Aza-CdR（3μM）和PBA（3 mM）处理48小时的HepG2细胞中差异表达的MiRNA（p<0.01）。（B）miRNA微阵列数据总结，与对照组相比，其变化至少为3倍（p值通过方差分析计算）。（C）用对照载体或5-Aza-CdR和PBA处理48小时的HepG2和Huh7细胞中成熟miR-122的qRT-PCR分析。数据归一化为U6 RNA。（D）用对照载体或5-Aza-CdR和PBA处理48小时的HepG2和Huh7细胞中pri-miR-122的qRT-PCR分析。（E）肝癌细胞系与人原代肝细胞miR-122表达的qRT-PCR比较。（F）用5-Aza-CdR（3μM）和PBA（3 mM）处理48小时后，人原代肝细胞miR-122表达的qRT-PCR。数据表示平均值+SD（***P<0.001，n=3）。
图2
图2。5-Aza-CdR/PBA诱导miR-122表达的PPARγ/RXRα复合物
（A）5-Aza-CdR/PBA诱导内源性PPARγ/RXRα与DR1和DR2共识位点结合。（上面板）人类miR-122基因启动子中假定PPARγ/RXRα结合位点的示意图。（中间面板）将来自HepG2细胞的等量细胞裂解物与miR-122启动子中对应DR1和DR2基序的生物素化双链寡核苷酸以及甾体亲和素-琼脂糖珠孵育。对沉淀的复合物进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。（下面板）Western blot检测经或不经5-Aza-CdR/PBA处理的HepG2细胞中的PPARα。（B）在PPARγ过度表达的HepG2细胞中，5-Aza-CdR/PBA诱导PPARγ/RXRα与miR-122 DR1和DR2基序结合。PPARγ表达载体瞬时转染后，用5-Aza-CdR/PBA处理细胞48小时，获得细胞裂解物进行DNA下拉分析。（C）ChIP分析。从用5-Aza-CdR/PBA或对照载体处理的HepG2细胞中提取的染色质用PPARγ抗体进行免疫沉淀，并使用引物对沉淀进行qRT-PCR分析，以扩增DR1和DR2区域，如示意图所示（箭头显示miR-122启动子中的引物区域）用正常兔IgG作为阴性对照。（D）5-Aza-CdR和PBA对HepG2和Huh7细胞中miR-122启动子荧光素酶活性的影响。在短暂转染miR-122-Luc启动子载体后，对细胞进行5-Aza-CdR和PBA处理48小时，获得细胞裂解物以检测荧光素酶活性。（E）经PPARγ激动剂（15-d-PGJ）处理的HepG2细胞成熟miR-122的qRT-PCR2，15-酮-PGE2)或RXRα激动剂（9-cis RA）。用PPARγ表达载体或对照载体瞬时转染细胞，并用DMSO或10μM激动剂孵育细胞24小时。qRT-PCR检测成熟miR-122。（F）用10μM PPARγ激动剂（罗格列酮、曲格列酮和西格列酮）或载体对照（DMSO）处理的PPARγ过表达的HepG2细胞中成熟miR-122的qRT-PCR。（G）用PPARγsiRNA或PPARγ表达载体转染NeHepLxHT细胞中成熟miR-122的qRT-PCR（上面板）western blotting证实NeHepLxHT细胞中PPARγ的敲除或过度表达（下面板）数据表示平均值+SD（***P<0.001，n=3）。
图3
图3。5-Aza-CdR/PBA诱导的miR-122表达与N-CoR/SMRT共表达载体分离和SUV39H1抑制相关
（A）用对照载体或5-Aza-CdR/PBA处理的HepG2细胞中内源性N-CoR和SMRT与miR-122 DR1和DR2基序的结合。（B）5-Aza-CdR和PBA对HepG2细胞中PPARγ与N-CoR、SMRT和SUV39H1相关性的影响。（左侧面板）用抗PPARγ抗体免疫沉淀细胞裂解物，然后用指示的抗体免疫印迹。（右侧面板）使用指示抗体的常规免疫印迹法。（C）5-Aza-CdR和PBA对HepG2和Huh7细胞中SUV39H1表达的影响。用5-Aza-CdR/PBA处理细胞48小时，获得细胞裂解物，用抗SUV39H1抗体进行Western印迹。（D）SUV39H1与miR-122 DR1和DR2图案的结合。用5-Aza-CdR和PBA处理HepG2细胞48小时，细胞裂解物与生物素化的DR1和DR2寡核苷酸孵育。使用抗SUV39H1对样品进行免疫印迹。（E）SUV39H1敲低对miR-122表达的影响。用靶向SUV39H1的两种不同的siRNA（100nM）或模拟siRNA转染HepG2细胞作为对照。转染72小时后通过western blotting分析SUV39H1敲除的效率（左侧面板）对成熟miR-122进行qRT-PCR（右侧面板）.（F）SUV39H1抑制剂毛霉素增加了HepG2和Huh7细胞中miR-122的表达。用200 nM毛霉素处理细胞48小时，并进行qRT-PCR以确定miR-122的水平。（G）5-Aza-CdR/PBA对组蛋白乙酰化的影响（染色质免疫沉淀分析）。用5-Aza-CdR/PBA或对照载体处理HepG2细胞提取的染色质，用抗乙酰组蛋白抗体进行免疫沉淀。使用引物对沉淀进行qRT-PCR分析，以扩增miR-122基因启动子的DR1和DR2区域，如示意图所示。数据表示平均值+SD（***P<0.001，**P<0.01；n=3）。
图4
图4。丙型肝炎病毒对miR-122表达的影响
（A）用JFH1-GFP-HCV病毒感染Huh7.5细胞96小时。（上面板）荧光显微镜显示感染JFH1-GFP-HCV的细胞中GFP的细胞内表达。（下面板）对JFH1-GFP-HCV感染或未感染细胞中HCV RNA的qRT-PCR分析。（B）用qRT-PCR分析96小时内有无JFH1-GFP-HCV感染的Huh7.5细胞中的miR-122。结果被归一化为U6 RNA水平。（C）无论是否感染JFH1-GFP-HCV，96小时后Huh7.5细胞中miR-122启动子荧光素酶报告活性。
图5
图5。乙型肝炎病毒对miR-122表达的影响
（A）HepG2.2.15细胞培养72小时；从HepG2.2.15细胞或上清液（400μl）中提取DNA。HBV特异性引物qRT-PCR检测HBV DNA（左侧面板）将HepG2细胞及其上清液用作阴性对照。在HepG2和HepG2.2.15细胞中对成熟miR-122进行qRT-PCR分析（右侧面板）.（B）用HBV接种物感染HepaRG细胞20小时并孵育7天。每2天更换一次培养基。孵化结束时，在培养基和HBV感染细胞中检测到HBV DNA（左侧面板）对从未感染或HBV感染的HepaRG细胞中提取的总RNA进行miR-122的qRT-PCR分析（右侧面板）.（C）用HBV接种物感染人原代肝细胞5或7天。HBX mRNA水平（左侧面板）和miR-122表达水平（右侧面板）通过qRT-PCR测定。GAPDH mRNA和U6水平作为内部对照。数据表示平均值+SD（***P<0.001，**P<0.01；n=3）。
图6
图6。HBX对miR-122表达的影响
（A）HBX表达载体或对照载体转染HepG2和Huh7细胞48小时后miR-122的qRT-PCR分析（左侧和中间面板）用HBX转染人原代肝细胞72小时，用qRT-PCR测定miR-122的表达水平（右图）。（B）用HBX表达载体或对照载体转染后48小时，HepG2和Huh7细胞中miR-122启动子荧光素酶报告活性（***p<0.001）。（C）使用脂质体将Mock-siRNA和HBX-siRNA（100 nM）转染到HepG2.2.15细胞中。HBX蛋白水平（左上面板）或mRNA（左下面板）western blot和qRT-PCR检测（转染72小时后）。通过qRT-PCR测定对照组和HBX-siRNA转染HepG2.2.15细胞中miR-122的表达水平（右侧面板）.（D）HBX与PPARγ相关。用HBX表达载体或对照载体转染HepG2细胞，细胞裂解物用抗PPARγ抗体免疫沉淀，然后用抗HBX抗体免疫印迹（上面板）HBX转染细胞或载体控制细胞中HBX和β-肌动蛋白的常规蛋白质印迹显示在下部面板.（E）qRT-PCR分析转染HBX和/或PPARγ的HepG2细胞中成熟miR-122。数据表示平均值+SD（***P<0.001，n=3）。（F）转染HBX和/或PPARγ的HepG2细胞中pri-miR-122的qRT-PCR分析。
图7
图7。miR-122表观遗传调控机制示意图
肝癌细胞和肝细胞中miR-122的表观遗传调控涉及PPARγ/RXRα/N-CoR/SMRT/SUV39H1/DR1/DR2结合复合物、组蛋白乙酰化和组蛋白H3K9甲基化。5-Aza-CdR和PBA治疗抑制SUV39H1的表达，并导致辅抑制复合物（N-CoR/SMRT/SUV39H2）与PPARγ/RXRα/DR1/DR2分离，从而允许PPARγ/RXRα诱导的miR-122基因转录。乙型肝炎病毒X蛋白通过直接结合抑制PPARγ，从而下调miR-122的表达。
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