Direct imaging of ER calcium with targeted-esterase induced dye loading (TED)

doi:10.3791/50317

.2013年5月7日：（75）：e50317。

doi:10.3791/50317。

靶向酯酶诱导染料负载（TED）直接成像内质网钙

萨米拉·桑特利本¹, 朱利安·贾佩尔, 卡罗琳·费彻, 托马斯·安德烈斯卡, 马库斯·雷贝里, 罗伯特·布仑姆

附属公司

PMID： 23685703
预防性维修识别码：下午3679584
内政部： 10.3791/50317

靶向酯酶诱导染料负载（TED）直接成像内质网钙

萨米拉·桑特利本等。 J视觉实验. 2013.

.2013年5月7日：（75）：e50317。

doi:10.3791/50317。

作者

萨米拉·桑特利本¹, 朱莉安·贾佩尔, 卡罗琳·费彻, 托马斯·安德烈斯卡, 马库斯·雷贝里, 罗伯特·布仑姆

附属

¹乌尔兹堡大学临床神经生物学研究所。

PMID： 23685703
预防性维修识别码：项目经理3679584
内政部： 10.3791/50317

摘要

钙动力学的可视化对于理解钙在细胞生理学中的作用非常重要。为了检测钙的动力学，合成荧光钙指示剂已成为流行的方法。在这里，我们展示了TED（=靶向酯酶诱导的染料负载），这是一种改善不同细胞类型的ER腔内Ca（2+）指示染料释放的方法。迄今为止，TED已用于体外细胞系、胶质细胞和神经元。TED的基础是使用表达羧酸酯酶（CES）的载体构建物，高效、重组地靶向内质网腔的高羧酯酶活性。最新的TED载体包含CES2的核心元素，与红色荧光蛋白融合，从而实现同时双色成像。内质网中游离钙的动态以一种颜色显示，而相应的内质网结构以红色显示。在程序开始时，细胞被慢病毒转导。随后，将受感染的细胞接种在盖玻片上，最终实现活细胞成像。然后，用低亲和力Ca（2+）指示剂的乙酰氧基甲酯（AM-ester）形式培养活细胞，例如Fluo5N-AM、Mag-Fluo4-AM或Mag-Fura2-AM。ER中的酯酶活性从Ca（2+）指示剂和亲水荧光染料/Ca（2+）的AM形式中分离疏水侧链复合物形成并滞留在内质网腔中。染料加载后，细胞在倒置共焦激光扫描显微镜下进行分析。细胞连续灌流林格样溶液，通过延时成像直接显示内质网钙动力学。内质网钙释放通过感兴趣区域的荧光强度降低来确定，而内质网钙质库的重新填充会导致荧光强度增加。最后，通过计算ΔF/F0确定荧光强度随时间的变化。

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