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.2013;9（5）：e1003358。
doi:10.1371/journal.ppat.1003358。 Epub 2013年5月9日。

单分子敏感性FISH分析显示，病毒出芽前细胞质中不同流感病毒RNA片段的共定位

周一英 1, 尼古拉斯·希顿, 秦山高, 帕雷斯, 罗伯特·辛格, 蒂莫塞·利奥内特
附属公司

单分子敏感性FISH分析显示，病毒出芽前细胞质中不同流感病毒RNA片段的共定位

周一英等。 公共科学图书馆病理学. 2013.

勘误表in

  • 《公共科学图书馆·病理学》。2013;9（7）：doi/10.1371/annotation/8f53e7f2-2348-436f-b37e-a883a01e9bbd。歌手，罗伯特【更正为歌手，罗伯特H】

摘要

甲型流感病毒基因组由八个负义单链RNA片段组成。虽然已经确定大多数病毒颗粒都含有八种病毒RNA中每一种的单一拷贝，但包装选择机制仍不清楚。流感病毒RNA在细胞核内合成，输出到细胞质，然后到达质膜，在那里发生病毒出芽和基因组包装。由于在分析相关vRNP的同时保留其在细胞内位置的信息方面存在困难，目前尚不清楚不同片段的病毒RNA在细胞贩运过程中如何以及在何处相遇。使用多色单分子敏感荧光原位杂交（smFISH）方法，我们定量监测了流感病毒RNA对在感染细胞中的共定位。我们发现，感染后，来自传入粒子的病毒RNA一起传播，直到到达细胞核。然后在细胞核的不同位置检测到病毒RNA；然后它们被单独输出，最初在细胞质中保持分离。在以后的时间点，不同的病毒RNA片段以微管独立的方式聚集在细胞质中。当不同身份的病毒RNA与Rab11阳性囊泡相关时，它们以较高的频率共定位，这表明Rab11正细胞器可能促进不同病毒RNA的关联。使用缺乏HA或M2蛋白表达的工程流感病毒，我们发现这些病毒蛋白对细胞质中两种不同病毒RNA的共定位不是必需的。总之，我们的smFISH结果显示，病毒RNA在到达质膜出芽部位之前，在细胞质中一起旅行。基因组包装过程的这一新特征步骤证明了感染周期的精确时空调控。

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数字

图1
图1。流感病毒RNA的单分子敏感性FISH和共定位分析。
(A类)MDCK细胞在MOI=5时感染PR8并固定在2 hpi时的图像（最大强度投影）。使用Cy5标记的探针针对PB2段和Cy3标记的探针对抗NA段，对细胞进行PB2和NA vRNA的检测。上部面板显示在Cy5和Cy3通道中采集的荧光图像堆栈的最大投影。下部面板显示了与上述荧光图像相对应的检测到的斑点的2D表示。每个都表示为一个正方形。正方形区域的放大图像显示在每个面板的右侧。检测到的斑点的合并图像显示了Cy5和Cy3斑点之间的空间关系。比例尺=10µm。(B)MDCK细胞在MOI=5时感染PR8病毒，并固定在6 hpi（最大强度投影）。两个探针组，24个Cy3标记探针和24个Cy5标记探针，靶向NA vRNA的不同区域，用于杂交。左上角：显示DAPI、Cy3和Cy5通道的合并荧光图像（比例尺=10µm）。为了进行比较，显示了每个颜色通道中放大的方框区域和相应的检测点。比例尺=5µm。(C)流感病毒NA vRNA和细胞β-actin mRNA的克隆化分析。MDCK细胞在MOI=5时感染PR8病毒，并固定在8 hpi（最大强度投影）。将细胞与针对NA vRNAs的Cy5标记探针和针对宿主β-actin mRNA的Cy3标记探针杂交。显示每个颜色通道中放大的方框区域和相应的检测点以进行比较。比例尺=低倍图像中的10µm，放大图像中的5µm。(D类)显示了与NA vRNA相对应的Cy3和Cy5斑点的定殖效率。共定位效率被确定为共定位斑点与NA斑点的比率。(E类)流感病毒核酸vRNA和β-肌动蛋白mRNA在8 hpi时共定位效率的定量。共定位效率是通过将共定位点的数量除以NA vRNA点的数量来计算的。
图2
图2。感染后不同时间点PR8病毒感染细胞中PB2和NA vRNAs的克隆化。
MDCK细胞在MOI=5时感染PR8病毒，并在感染后的不同时间点固定。然后使用Cy5标记的探针对抗PB2 vRNAs和Cy3标记的探针抗NA vRNAs.进行双色FISH。(A类)荧光图像表示PB2 vRNA（Cy5）、NA vRNA（Cy3）和细胞核（DAPI）。在2、4、7、10和12 hpi时拍摄的典型图像显示在每条车道上（最大强度投影）。比例尺=10µm。装箱区域的放大视图显示在每个车道的最右侧面板中。比例尺=5µm。调整图像对比度，使细胞质单分子清晰可见。由于vRNA密度高，一些细胞核在这些设置下均匀发光。(B)和(C)核内PB2和NA vRNAs共定位效率的量化(B)和细胞质(C). 控制共定位效率表示当两个不同标记的探针集都以NA vRNA为靶点时，Cy3和Cy5信号之间检测到的效率(D类)感染后不同时间点感染细胞中PB2和NA vRNAs的平均每细胞拷贝数。每个细胞的平均vRNA拷贝数是通过用图像中检测到的PB2和NA vRNA分子的总和除以细胞核数来计算的。对每个时间点共五张包含80多个细胞的图像进行分析。
图3
图3。PB2和NA vRNAs在感染的第一个小时内结直肠化。
MDCK细胞在含有DMSO、20 mM氯化铵（NH）的培养基中培养4在MOI=100的情况下，PR8病毒感染期间，Cl）、100µM importazole（IPZ）或40 ng/ml钩体霉素B（LMB）。在感染后20分钟、40分钟和60分钟，使用靶向PB2 vRNA的Cy5探针和靶向NA vRNAs的Cy3探针进行双色FISH。(A类)对于每个实验条件，显示了三维荧光图像的四个最大强度投影。左上角的图像显示了Cy5、Cy3和DAPI通道的合并图像。DAPI染色（蓝色）染色细胞的细胞核。方形区域的放大图像显示在右上角（NA，红色斑点）、左下角（PB2，绿色斑点）和右下角（Cy3和Cy5信号与DAPI的合并图像）。比例尺=5µm。(B)感染后20分钟、40分钟和60分钟用不同药物处理的PR8病毒感染MDCK细胞的细胞核中PB2和NA的克隆化效率。(C)PR8病毒感染MDCK细胞后20、40和60分钟用不同药物处理后，其细胞质中PB2和NA的克隆化效率。细胞核中vRNA的平均拷贝数（PB2和NA vRNA的总和）(D类)和细胞质(E类)显示了用不同药物处理的细胞。对于每个实验条件，分析了40多个细胞。在实验组和模拟治疗组之间的每个时间点进行未配对的学生t检验。a： p值<0.05，b:p值<0.01，c:p值<0.001，d:p值<0.001，ns:无显著性。
图4
图4。PB2和NA vRNAs的共定位与微管无关。
(A和B)分别使用Cy5-或Cy3-荧光标记探针对感染MOI=5的PR8病毒的MDCK细胞微管（蓝色）和双色smFISH进行免疫荧光染色，以对抗PB2-vRNAs（绿色）或NA-vRNA（红色）。(A类)显示了4和6 hpi时细胞微管、PB2和NA vRNAs的二维合并图像（每个面板的左上角图像）。方框区域的放大图像显示在右上角；还显示了在每个通道（底部）拍摄的放大图像，以及PB2和NA vRNA斑点之间的合并图像（中间，右侧）。比例尺=10µm。(B)显示了PB2和NA vRNAs之间共定位的量化。与微管相关的共定位vRNAs比例以深灰色表示，未与微管共定位的共定位vRNAs以浅灰色表示。与微管相关的共定位vRNAs的百分比在4hpi为24.5%，6hpi为10.3%，8hpi为4.1%。误差线表示标准偏差。(C)定量与微管相关（深灰色）或与微管无关（浅灰色）的PB2和NA vRNA之间的共定位。误差线表示标准偏差。ns：非配对t检验无显著性。(D&E公司)MDCK细胞在MOI=5时感染PR8病毒，并在1.5 hpi时用诺卡唑（NOC）处理。(D类)将处理后的细胞固定在8 hpi进行smFISH分析。显示了模拟处理或NOC处理细胞的Cy5荧光（PB2-vRNAs）、Cy3荧光（NA-vRNA）、Alexa 488信号（细胞膜）和合并图像（最大强度投影）。Alexa-488结合的小麦胚芽凝集素（WGA）对细胞的质膜和高尔基体进行染色。比例尺=5µm。(E类)显示了模拟处理和NOC处理细胞中PB2和NA vRNAs的克隆化效率。对于每个实验条件，分析了50多个细胞。误差线表示标准偏差。ns：非配对t检验无显著性。
图5
图5。Rab11参与PB2和NA vRNAs的共定位。
(A–C)A549细胞在MOI=5时感染PR8病毒，并固定在6、8和10 hpi。使用抗Rab11抗体进行免疫荧光染色，然后使用Cy5标记的PB2探针和Cy3标记的NA探针进行双色smFISH。(A类)6、8和10 hpi时细胞的合并荧光图像显示在左上角（最大强度投影）。对于每个面板，方框区域将被放大并显示在右上角。PB2 vRNA（绿色）、NA vRNA（红色）和Rab11（蓝色）的放大图像显示在底部，PB2和NA vRNA信号的合并图像显示在右中部。比例尺=5µm。(B)6、8和10 hpi时细胞质中PB2和NA vRNA的定殖效率。与Rab11共定位的共定位vRNA以深灰色表示，而与Rab11不相关的共定位vRNA以浅灰色表示。与Rab11相关的共定位vRNA的百分比在6hpi时为31.3%，在8hpi时为44.9%，在10hpi时为38.8%，在随机对照中为24%。误差线表示标准偏差。(C)在6、8和10 hpi时，与Rab11相关和不相关的PB2和NA vRNAs在细胞中的克隆化效率。随机对照表示当vRNA被随机分为Rab11相关组和Rab11非相关组时，PB2和NA vRNA的共定位效率。误差条表示标准偏差。***：t-检验p值<0.001，**:t-检验p-值<0.01，**:t检验p值<0.05。(D&E公司)用1µg GFP-rab11-WT或GFP-rab21-DN转染A549细胞，并在转染后24小时以MOI=5感染PR8病毒。使用针对PB2 vRNAs的Cy5探针和针对NA vRNA的Cy3探针在8 hpi下进行双色smFISH。(D类)显示了转染WT-Rab11或DN-Rab11（最大强度投影）的细胞的图像。方框区域的放大图像如下所示：底部分别显示PB2 vRNAs（绿色）、NA vRNA（红色）和GFP标记的rab11蛋白（蓝色）；PB2和NA vRNAs的合并图像显示在右中角，而三个通道的合并图像位于面板的右上角。比例尺=5µm。(E类)PB2和NA vRNAs在WT-Rab11或DN-Rab11表达细胞中的克隆化。对GFP信号（表达GFP标记的rab11蛋白）检测到的单个细胞，分析PB2和NA vRNAs的共定位效率。黑点表示WT-Rab11转染细胞中vRNAs的共定位效率，而红色方块表示DN-Rab11转基因细胞中的共定位率。误差条代表标准偏差。***：t检验p值<0.001。
图6
图6。PB2和NA vRNAs的共定位与病毒蛋白HA和M2的表达无关。
(A和B)MDCK细胞被野生型PR8（WT-PR8）或PR8-HA-GFP-HA病毒感染，并在4、6和8 hpi下固定进行针对PB2和NA vRNAs的双色smFISH分析。(A类)感染WT-PR8和PR8-HA-GPF-HA病毒的细胞在8 hpi（最大强度投影）时的DAPI信号（蓝色）、PB2-vRNAs的Cy5荧光（绿色）和NA vRNA的Cy3荧光（红色）。比例尺=10µm。(B)显示了感染WT-RP8或PR8-HA-GFP-HA病毒的细胞细胞质中PB2和NA vRNAs的克隆化效率。误差线表示标准偏差。ns:t检验p值>0.05；没有意义。(C&D公司)MDCK细胞在MOI=5时感染PR8-WSN-M或PR8-WSN-ΔM2，并在6和8 hpi时进行针对PB2（Cy5标记）和NA（Cy3标记）的双色FISH vRNAs。(C)感染细胞在8 hpi（最大强度投影）下与Cy5 PB2探针（绿色）和Cy3 NA探针（红色）杂交的荧光图像。DAPI染色（蓝色）染色细胞的细胞核。比例尺=10µm。(D类)感染PR8-WSN-M或PR8-WSN-ΔM2的细胞细胞质中PB2和NA vRNAs的克隆化效率。误差线表示标准偏差。ns：非配对t检验无显著性。
图7
图7。提出了在感染细胞中不同vRNA片段的分解和共定位模型。
(1)流感病毒颗粒通过内吞途径进入细胞。(2)内切体酸化可使病毒包膜与内切体膜融合，并将vRNP释放到胞浆中。包装在病毒颗粒中的vRNP在向核传递过程中保持紧密联系。(三)核导入后，不同节段的相关vRNP在核内分解（结果如图3所示）(4)不同的vRNA在细胞核的不同区域复制，没有观察到vRNA的片段特异性积累（结果见图2和图3）。(5)新合成的vRNP被单独输出到细胞质中，不同的片段在核输出后不久就不相互关联（图2和3中的结果）。(6)在vRNP运输到质膜的过程中，vRNP通过与Rab11的结合被装载到再循环的内体上。然后，不同节段的vRNP开始相互共定位，并作为八个不同vRNP的预形成复合物一起向心尖质膜移动。(7)当复合物到达质膜时，八种不同的vRNP被包装成一个整体，进入正在萌发的病毒。
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