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。2013年5月8日；33(19):8411-22.
doi:10.1523/JNEUROSCI.3285-12.2013。

体内刺激诱导的血管舒张在没有IP3受体激活的情况下发生，可能先于星形细胞钙升高

Krystal Nizar公司 1, 哈娜·乌利洛娃, 田培芳, 巴亚姆A赛桑, 群诚, 利迪娅·雷兹尼琴科, 金伯利·L·韦尔迪, 泰勒C骏马, 毗湿奴B斯里达尔, 克里斯托弗·麦克唐纳, 崔建霞, 谢尔盖·格雷西, 萨瓦·萨卡齐奇, 大卫·A·博厄斯, 托马斯·贝卡, 高特·艾内沃尔, Ju Chen先生, 埃利泽·马西利亚, 安德斯·M·戴尔, 加布里埃尔·A·席尔瓦, 安娜·德沃
附属公司

体内刺激诱导的血管舒张在没有IP3受体激活的情况下发生，可能先于星形细胞钙升高

Krystal Nizar公司等。 神经科学。 。

摘要

血管活性神经递质的钙依赖性释放被广泛认为会触发与神经元活性快速增加相关的血管舒张。与这一假设不一致的是，在肌醇1,4,5-三磷酸（IP3）2型受体（R2）敲除（KO）小鼠中观察到完整刺激诱导的血管舒张作用，其中星形细胞钙增加的主要机制是在激活IP3依赖性途径后，细胞内储存的钙释放缺乏。此外，我们在野生型（WT）小鼠中的结果表明，相对于同时测量的小动脉扩张开始时间，在体内，星形细胞钙对感觉刺激的反应开始时间可能会大大延迟。在WT小鼠的星形细胞胞体和血管周围终末均观察到延迟钙升高。因此，星形胶质细胞可能在血流反应的启动中不起作用，至少不是通过钙依赖机制。此外，在IP3R2-KO动物中，正常血管舒张不需要增加星形细胞内钙。

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数字

图1。
图1。
刺激诱导反应期间星形胶质细胞和神经细胞钙信号之间的相互作用。A类，通过缩小（“侵蚀”）OGB1染色皮层中的星形细胞ROI来减少与neuropil信号的串扰。一个示例FOV包括一些标记有SR101/OGB1的星形胶质细胞和一些标记有OGB1的神经元细胞体，在皮质表面以下190μm处成像。比例尺，20μm。单细胞ROI（标记为“A”的星形细胞胞体）的逐渐侵蚀如右图所示：从SR101强度（m1）自由阈值定义的遮罩开始，一次侵蚀一层像素（m2-6）。为了便于查看，遮罩相对于合成图像进行了放大。B类，从中显示的掩码中提取的时间进程A类所有时间进程都是基线提取和峰值标准化的，以说明侵蚀过程选择性地减少了神经膜（黑色箭头）的污染，同时保留了缓慢和大幅度的“真实”星形细胞信号。神经膜（即神经元和星形细胞胞体外部）中的钙信号变化以ΔF/F表示，以绿色显示。黑色条表示刺激持续时间。C类，用Fluo-4和SR101标记的示例FOV在皮层表面以下180μm处成像。合成图像的黄色表示Fluo-4（绿色）和SR101（红色）在星形胶质细胞中的共定位。比例尺，30μm。D类，钙信号时间进程，表示为ΔF/F，从合成图像中概述的ROI中提取C类黑色条表示刺激持续时间。E类，一个非校正MUA电压轨迹示例，说明在一次刺激试验中对六个连续刺激的反应。MUA记录与光学采集同时进行，以确保神经元对刺激的反应。
图2。
图2。
IP（IP）三R2-KO小鼠未表现出IP3介导的钙升高。A类，对1m微注射的响应示例米ATP成像于WT受试者皮层表面以下100μm处。左边是OGB1（绿色）、SR101（红色）和注射用微量吸管（蓝色）的合成图像。对，星形细胞ROI。比例尺，20μm。B类，从星形细胞ROI中提取的钙信号时间过程A类。C类，如中所示B类对于IP三R2-KO主题。每条线代表单个星形细胞细胞体的时间进程。未显示合成图像和ROI。D类，WT受试者星形细胞钙的起始值随着ATP的反应而增加，这是与注射吸管距离的函数。IP中的星形胶质细胞三R2-KO受试者没有表现出钙升高，也没有被标绘出来。E类，微注射10μ的示例响应米t-ACPD在WT受试者皮层表面下120μm处拍摄到图像：前3次吹气诱发的定时钙增加，随后出现不规则振荡。F类，如中所示E类对于IP三R2-KO主题。
图3。
图3。
IP（IP）三R2-KO小鼠出现正常的功能性充血。A类、WT和IP小动脉直径变化的时间进程三R2-KO受试者（分别为顶部和底部面板）。覆盖每个类别的所有测量值。平均值叠加在每个面板上（粗线）。刺激开始由灰色垂直线表示。插入图中叠加了跨学科平均数，以便于进行时间比较；误差线表示平均值的95%置信区间。B类WT（实心点）和IP中所有测量到的小动脉直径变化的起始点（顶部）和峰值时间（底部）三R2-KO（开放三角形）受试者，摘自A类覆盖所有受试者的数据，并将其表示为皮层深度的函数。C类，比较表面小动脉的成对直径和速度测量值。直径（黑色）和速度（绿色）时间进程的跨主题平均值。首先，我们平均了一个科目中获得的所有时间课程。然后，在计算受试者的平均值之前，用峰值振幅对平均时间进程进行标准化；误差线表示受试者的SE。速度的增加先于直径的增加(第页< 0.01). 这种行为与分布式血管网络的理论预期一致，即当深层皮质层发生最快扩张时（Boas等人，2008年）。D类，同时测量直径和速度的示例。在左侧，扫描路径以红色叠加在表面微动脉的FITC图像上。沿着血管的扫描路径的一段用于基于右上角α表示的时间堆叠线中条纹的角度来估计速度（见材料和方法）（Kleinfeld等人，1998）。血管扫描路径的一段用于根据轮廓的膨胀计算膨胀（右上角的红色箭头）。相应的直径（黑色）和速度（绿色）时间过程显示在右下角。
图4。
图4。
在没有星形细胞钙反应的情况下观察到小动脉扩张。A类，典型的FOV包括标记有SR101/OGB1的血管周围星形胶质细胞，通过血管内注射FITC标记的潜水小动脉，以及标记有OGB1的许多神经元细胞体，在皮质表面以下150μm处成像。用于提取时间进程的ROI显示在右侧。B类，从ROI中提取的时间进程，如所示A类星形细胞（红色）和神经元（绿色）钙信号变化用ΔF/F表示。血管舒张用相对于基线直径Δd/d的直径变化百分比表示。直径变化是从FITC-标记的血管内管腔扩张中提取的，用“v”表示A类黑色条表示刺激持续时间。C类，比率图像显示神经元信号变化和血管舒张（黑色箭头）对第一次刺激试验的反应。覆盖ROI轮廓。每个图像都是五个连续比率帧的平均值。图像上方显示了与刺激开始相关的相应时间窗口（以秒为单位）。注意连续图像之间的0.5秒间隙。比例尺：A类,C类，10微米。D类，FOV上部的“原始”试验平均图像，说明相对于预刺激基线（顶部，红色虚线）在峰值扩张（底部）期间FITC-标记横截面的扩张。显示绿色通道。E类，从单个神经元细胞体提取的钙信号时间过程的典型示例（黑色痕迹；标记为“n1”inB类). 钙信号的变化表示为ΔF/F。数据的计算拟合用红色覆盖。拟合过程假设为τ=0.8 s的卷积核。底部的黑色条表示刺激持续时间。一般来说，神经元对刺激序列中6个电脉冲的每一个都会产生1-2个尖峰。
图5。
图5。
星形胶质细胞对个别刺激试验偶尔表现出钙反应。A类例FOV位于小动脉分支点下方20μm处，包括三个星形细胞ROI，在皮质表面下方200μm处成像。未出现血管内FITC。B类，从星形细胞和神经元ROI提取的时间进程如所示A类红色箭头表示在10个刺激试验中的2个试验中，其中一个ROI（a1）中的钙增加。C类，神经元反应期间刺激开始后前1.8秒的试验平均比率图像。每个图像是两个连续帧的平均值。连续图像之间的强度波动反映了神经细胞膜和神经元细胞体对重复刺激（6个3 Hz的单独刺激）的响应在时间上采样不足的“闪光”。ROI轮廓A类被覆盖。图像上方显示了与刺激开始相关的相应时间窗口（以秒为单位）。D类，第九次刺激试验的比率图像，以标记为a1的星形细胞ROI中的钙反应为特征。与刺激开始相关的时间（以秒为单位）显示在图像上方。注意连续图像之间的1s间隙。比例尺：A类,C类,D类，10微米。
图6。
图6。
星形细胞反应动力学与小动脉距离的关系。A类,B类，重叠所有试验的时间进程，有明显的星形细胞信号改变，在受试者之间汇集，按与潜水小动脉的距离排序：在(A类)和外部(B类)半径为50μm。C类，受试者之间两种距离类别的星形细胞反应动力学的统计比较：<50μm（红色）和>50μm的（蓝色）。曲线显示了跨主题平均值；误差条指示SE。
图7。
图7。
相对于小动脉扩张，星形细胞钙增加延迟。A类，重叠了所有有明显星形细胞信号改变的试验的时间进程，将具有（左）和不具有（右）血管内FITC的受试者合并，用于同时测量血管舒张。B类所有测量的星形细胞钙反应（红色）和小动脉直径变化（黑色）的开始时间（顶部）和峰值时间（底部）。所有受试者的数据都被覆盖，并作为皮层深度的函数表示。开口正方形和实心点分别对应于同时（st）和独立（sa）测量。包括同时测量的直径，而不考虑星形细胞钙反应的存在。C类、星形细胞钙变化的时间进程（顶部）和小动脉直径变化的时间历程（底部）。平均值叠加在每个面板上（粗线）。刺激开始由灰色垂直线表示。插入图中叠加了峰值归一化平均值，以便于进行时间比较。
图8。
图8。
星形细胞终末钙的增加滞后于扩张的开始。A类，一个包含两个星形胶质细胞的示例FOV，一个（a1）具有连接的端足（EF），在皮质表面下260μm处成像。B类，从ROI中提取的时间进程如所示A类红色箭头表示在第七次刺激试验后，末梢的钙增加。C类，神经元反应期间刺激开始后的前～2.5秒的试验平均比率图像。每个图像是两个连续帧的平均值。ROI轮廓A类被覆盖。图像上方显示了与刺激开始相关的相应时间窗口（以秒为单位）。注意连续图像之间的1s间隙。D类，第七次刺激试验的比率图像。覆盖ROI轮廓。每个图像都是作为10个连续比率帧的平均值进行计算的。在图像上方指示了相对于刺激开始的对应时间窗口。注意连续图像之间的1s间隙。比例尺：A类,C类,D类，10微米。E类，细胞体（a1，黑色）和连接端足（EF，红色）中星形细胞钙变化的重叠时间过程。F类，覆盖所有响应端脚测试。平均值显示为厚红色。来自同一深度类别（180–300μm）的平均膨胀时间过程，归一化为钙记录道的最大振幅，叠加在厚黑色中。
图9。
图9。
精细星形细胞树枝状结构中钙的增加滞后于扩张的开始。A类，用Fluo-4和SR101标记的示例FOV在皮层表面以下200μm处成像。B类，亚细胞ROI覆盖在Fluo-4比率图像的MIP图像上。计算3次刺激试验的时间序列的MIP图像。通过为单个刺激试验计算的MIP图像阈值来定义单个ROI。比例尺：英寸A类,B类，50微米。C类，从ROI中提取的钙信号时间过程如所示B类（红色迹线）和整个视野（“Fluo-4场”，蓝色迹线）。黑色条表示刺激持续时间。D类，平均Fluo-4现场响应。同一深度类别（≤200μm）星形胶质细胞体ROI的平均扩张时间进程和钙反应分别以黑色和红色叠加。所有曲线均归一化为最大振幅。
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