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.2013年5月；140(10):2235-43.
doi:10.1242/dev.091520。

斑马鱼和鸡的诱导性转基因表达系统

塞巴斯蒂安·S·盖里 1, 玛丽·A·布鲁, 诺里亚基·萨赛, 徐启灵（Qiling Xu）, 詹姆斯·布里斯科, 大卫·G·威尔金森
附属机构

斑马鱼和鸡的诱导性转基因表达系统

塞巴斯蒂安·S·盖里等人。 开发. 2013年5月.

摘要

我们已经建立了一个诱导系统来控制斑马鱼和小鸡转基因表达的时间。在组织培养和转基因斑马鱼中，雌激素受体变体（ERT2）与GAL4转录激活剂快速融合，并在药物4-羟基-氨甲氧基芬（4-OHT）治疗后3小时内强烈激活转录。我们使用泛素（ubi）增强子生成了一个广泛表达的可诱导ERT2-GAL4斑马鱼系。此外，ERT2-GAL4与组织特异性增强子结合使用可以在空间和时间上控制转基因表达。这种空间限制和维持强制表达的能力是目前使用的热休克促进剂的重要优势。此外，与当前可用的TET和LexA系统相比，ERT2-GAL4与社区中不断增长的UAS线路兼容，这两个系统需要具有各自独特识别序列的单独构造。我们还将相同的诱导系统应用于鸡胚，发现其功能齐全，表明该策略普遍适用。

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数字

图1。
图1。
GAL4-VP16/雌激素受体LBD融合蛋白的定位和活性依赖于4-OHT。(A-I公司)当用抗GAL4抗体检测到ERT2-GAL4（图示，顶部）在HEK293细胞中的强制表达时，显示对照治疗中GAL4的细胞质定位（分别为E和H，蓝色和灰色），以及用5μM 4-OHT治疗16小时后的核富集（分别为F和I，蓝色和灰色）。（D，G）这与仅GAL4-VP16的构成核定位形成对比（D和G，分别为蓝色和灰色）。Nuclei标有DAPI（A-F，红色通道）。与这些样本中GAL4的定位一致，来自联合转染UAS的柠檬酸的表达：H2B-柠檬酸质粒（A-F，绿色通道中的柠檬酸）依赖于GAL4的核定位，因此ERT2-GAL4表达细胞中的4-OHT处理（比较B和C，绿色通道）。黄色箭头表示GAL4蛋白定位。
图2。
图2。
ERT2-GAL4的活性体内依赖于4-OHT，快速且对剂量敏感。(A-K公司)稳定表达ERT2-GAL4的转基因鱼系爪蟾EF1α启动子显示UAS-linked的稳健反式激活H2B-柠檬酸（C，D），绿色荧光蛋白dn案例9（G，H）或Myc-霍克斯b8a与对照组（A、B、E、F、I、绿色通道）相比，用0.5μM 4-OHT（均为绿色通道）隔夜处理（J、K）。在一些样品中，细胞核用DAPI（B，D，I-K，红色通道）和/或明场（A-H，灰色）标记，以使胚胎可视化。(L-V型)UAS连接的转基因转录的时间过程(就地ERT2-GAL4驱动的GFP、紫色杂交显示出4-OHT依赖性（N、Q、T中的对照组与O、R、U和P、S、V中的4-OHT处理组）。反应的动力学和强度是剂量依赖性的：在6小时的处理过程中，用5μM 4-OHT处理的胚胎比用0.5μM 4-OHT处理的胚胎（比较P、S、V和O、R、U）表现出更快、更强和更少的来自UAS驱动的转基因的镶嵌转录。用0.5μM 4-OHT（L中的对照，M中的4-OHT）隔夜处理的胚胎显示出强劲的GFP转录。胚胎在T期6小时时眼睛周围的浅色素沉着不是就地信号。
图3。
图3。
组织特异性ERT2-GAL4产生4-OHT依赖性、区域限制性的转基因表达活性。(A-E公司)ERT2-GAL4受HuC增强子/启动子控制的瞬时转基因显示来自共同注射UAS的强大神经元特异性表达：H2B-柠檬酸当用0.5μM 4-OHT处理胚胎过夜时，与对照组进行比较（比较B-E和A，绿色通道）。用抗HuC/D抗体染色显示该基因的内源性表达模式（A-E，红色通道）。A-C图像是整个胚胎厚度（36-40μm）的最大投影。D、E中的图像是C中胚胎5.7μm堆栈的最大放大投影(F-M公司)稳定转基因，其中cldnB公司增强子/启动子驱动ERT2-GAL4表现出稳定的5×UAS的强大诱导和4-OHT依赖性：H2B-柠檬酸转基因（比较J、K、L与F、G、H、绿色通道）。当用来自50%外胚层的1μM 4-OHT处理时，胚胎在迁移的侧线原基中表达Citrine，并在30 hpf时沉积神经肥大（K和J中的点椭圆分别为绿色通道）。UAS-linked的持久表达式柠檬酸在神经肥大中检测到48 hpf就地杂交柠檬酸成绩单（将M与I比较，红色圆圈紫色信号）。一些样品用DAPI共同染色以显示细胞核（F-H、J-L、红色通道）。J-L侧线结构外的其他柠檬酸阳性细胞反映了皮肤中Cldnb的表达。
图4。
图4。
ERT2-GAL4在泛素该启动子可将广泛的4-OHT依赖性活性驱动至受精后24小时。(A-K公司)稳定联合国大学：：ERT2-GAL4线与UAS交叉：：H2B-柠檬酸品系，胚胎用乙醇（A，D，G）或0.75μM 4-OHT（B，C，E，F，H-K）处理过夜，从50%皮下注射到21hpf。单个光学平面的共焦分析揭示了近无处不在的GAL4活性在一条线上以4-OHT依赖的方式存在（a、D、G与B、C、E、F、H、I、绿色通道中的柠檬酸，红色通道中的DAPI）。箭头表示柠檬酸阴性细胞。第二个独立联合国大学：：ERT2-GAL4系表现出更弱和更多的嵌合表达（J，K vs H，I，绿色通道中的柠檬酸，红色通道中的DAPI），表明插入位点依赖于泛素启动子活性。E、H中具有代表性的柠檬酸阴性细胞用箭头表示。(L（左）)从柠檬酸阳性胚胎中提取4-OHT，从18 hpf到42 hpf（24小时提取，洗脱液A、B和C）后柠檬酸与维持在4-OHT（+4-OHT）中的胚胎相比下降了67-85%(n个=3个离合器）（将+4-OHT与冲洗口A、B和C进行比较）。qPCR水平与4-OHT中保存的胚胎有关。误差线表示±标准误差（+4-OHT和冲刷条件之间的总体显著差异，t吨-测试，P（P）<0.002).
图5。
图5。
ERT2-GAL4驱动的表达足以产生获得功能表型体内. (A到O)来自泛素：：ERT2-GAL4鱼类杂交至UAS：：GFP-dn案例9用乙醇（A、B、F、G、K、L）或0.625μM 4-OHT（C-E、H-J、M-O）处理鱼，从50%的表层到18 hpf，然后添加10μM HA14-1处理2小时。活化caspase 3（红色通道）和GFP（绿色通道）染色显示，通过GAL4在胚胎干中广泛诱导显性阴性caspase 9的表达（将K、L与M、N、红色通道相比较），可以拯救HA14-1诱导的凋亡。在具有镶嵌型GAL4活性的胚胎中（绿色通道中的E、J、O、GFP），凋亡的拯救是GFP-dnCasp9表达细胞的细胞自主性（E、J和O，比较非重叠绿色和红色）。样品用DAPI（A-E，蓝色通道）共同染色，以显示所有细胞的细胞核。所有图像均为20 hpf时的行李箱侧视图。
图6。
图6。
ERT2-GAL4系统在鸡胚中起作用。(A-I公司)将含有14×UAS:：GFP和CMV:：RFP的质粒在没有（A-C）或有（D-I）EF1α：：ERT2-GAL4的情况下电穿孔到HH 11期胚胎的脊髓中，并在没有（A-F）或有（G-I）10μM 4-OHT的情况下培养(n个=每种条件4个胚胎）。治疗8小时后，只有在4-OHT存在的情况下才能观察到GFP的强烈表达（比较C、F和I）。RFP在B、E、H中的表达证实了这些样品中的有效电穿孔。（A，D，G）外植体整个胚胎的形态。
图7。
图7。
ERT2-GAL4系统在鸡神经板外植体中起作用。(A-R公司)含有EF1α：：ERT2-GAL4，UAS：：的质粒H2B-柠檬酸在HH期9+，将CMV：：βGal电穿孔到鸡胚的后神经板中，切除外植体并进行培养在体外在外植体暴露于对照或1μM 4-OHT后，我们进行了柠檬碱表达的时间过程：在指定的时间间隔（3,6,12小时）后，将外植体固定并用GFP和βGal抗体和DAPI染色(n个=每个条件和时间点4个胚胎）。我们发现，在开始使用1μM 4-OHT治疗后，在3小时内（E与B）可快速诱导柠檬酸表达，在12小时内（Q与N），80%以上的转染细胞表达柠檬酸。未经处理的外植体显示表达柠檬酸的细胞少于5%，表明GAL4活性依赖于4-OHT。β-Gal表达用于确定电穿孔的整体效率，DAPI染色（蓝色通道）用于显示所有细胞核。
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