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.2013年4月17日；33(16):6885-94.
doi:10.1523/JNEUROSCI.5180-12.2013。

MicroRNA-17-92簇增强胚胎皮层神经元的轴突生长

张毅（音） 1, 上野裕二, 西安双流, 本杰明·布勒, 王新丽（Xinli Wang）, 迈克尔·肖普, 张正刚
附属公司

MicroRNA-17-92簇增强胚胎皮层神经元的轴突生长

张毅（音）等。 神经科学. .

摘要

微小RNA（miRNA）调节树枝状体的发生和可塑性。然而，miRNAs在轴突中的生物学功能尚未得到广泛研究。在这里，我们使用在微流控室中培养的大鼠初级皮层神经元，发现神经元的远端轴突表达miR-17-92簇，并且在远端轴突中分别存在调节成熟miRNAs Dicer和Argonaute 2的产生和活性的蛋白质。皮质神经元中miR-17-92簇的过度表达显著增加了轴突的生长，而内源性miR-19a的远端轴突衰减是miR-17-82簇的关键miRNA，miRNA发夹抑制剂抑制了轴突生长。此外，miR-17-92簇的过度表达降低了远端轴突中的磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）蛋白，提高了哺乳动物雷帕霉素（mTOR）的磷酸化靶点。相反，miR-19a的远端轴突衰减增加了轴突中的PTEN蛋白和失活的mTOR，但不影响细胞体内的这些蛋白水平。PTEN的过度表达和内源性PTEN的减弱分别优于miR-19a对轴突生长的增强和抑制作用。轴突应用LY294002（一种磷酸肌醇3-激酶抑制剂）或雷帕霉素（一种mTOR抑制剂）可消除miR-17-92簇过度表达所增强的轴突外生长。总之，这些发现表明miR-17-92簇表达的轴突改变调节轴突的生长，miR-19a对PTEN蛋白水平的局部调节可能有助于轴突的增长。

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数字

图1。
图1。
培养的初级皮层神经元轴突中miR-17-92簇的分布。A–C共聚焦显微镜获得的典型双免疫荧光图像显示，在分隔的微流控室中培养的初级皮层神经元显示MAP2阳性(A类，绿色）和pNFH-阳性(A类，红色）胞体和胞体室中的突起(A类和轴突室中的pNFH阳性纤维(A类，轴突）。B类和C类是内框区域的高倍图像A类体细胞室和轴突室。D类实时RT-PCR分析显示miR-17-92簇的单个成员在轴突和细胞体中的相对表达。电子，的代表性图像就地杂交和免疫荧光染色显示，pNFH阳性轴突（pNFH和融合轴突）中存在miR-18a（亮场）和miR-19a（亮区）信号，pNFH-阳性轴突中没有使用对照探针的miRNA信号。F类,G公司，典型的免疫荧光图像显示Ago2(F类)和Dicer(G公司)免疫反应性轴突。中的值D类给出了三个不同实验的平均值±SE，每个实验有三个重复*第页<0.05和***第页< 0.001. 比例尺：A类,C类，50微米；电子,G公司，20微米。
图2。
图2。
miR-17-92簇过度表达对轴突生长的影响。A类，用荧光显微镜在轴突室获得的代表性平铺免疫荧光图像显示，培养物中DIV3、DIV4和DIV5上转染GFP-empty载体（empty）和GFP-miR-17–92载体（miR-17-92）的皮层神经元的GFP-阳性轴突。B类，定量数据显示GFP的平均长度+在这3d期间，轴突室中的轴突。N个=6/组*第页< 0.05, **第页<0.01，以及***第页< 0.001.C类，用延时显微镜在轴突室获得的典型亮场和荧光场显微图像显示GFP的生长+和GFP−转染GFP-empty载体（empty GFP）的皮层神经元轴突+和GFP−)和GFP-miR-17–92簇向量（miR-17-92 GFP+和GFP−)DIV5上。每个图像中的数字表示0和60分钟的时间。白色和红色箭头分别表示0和60min的生长锥。D类显示了60分钟内轴突生长的定量数据。N个=20 GFP+和N个=20 GFP−GFP-miR-17-92组的轴突；N个=21 GFP+和N个=22 GFP−GFP-空载体组的轴突*第页与GFP空载体组和GFP相比<0.05−GFP-miR-17-92组的轴突。比例尺：A类，100微米；C类，20微米。
图3。
图3。
miR-17-92簇过度表达对轴突PTEN蛋白的影响。A类Western blot数据显示，转染GFP空载体（empty vector）和GFP-miR-17–92簇（miR-17-92）的神经元的远端轴突和胞体中存在PTEN、pmTOR和pGSK-3β。Axon和soma在A类表示总蛋白分别从轴突和细胞体中提取，而p85和β-actin分别用作远端轴突和胞体的内部对照。N个= 3. *第页与GFP空载体相比<0.05。B类和C类共聚焦显微镜在轴突室获得的具有代表性的双重免疫荧光图像显示GFP+轴突(B类，绿色）和生长锥(C类，绿色）为PTEN免疫反应阳性(B类,C类，红色）。然而，转染GFP-miR-17–92簇的神经元的轴突和生长锥中PTEN信号显著减少(B类,C类，miR-17–92，红色）与GFP-空矢量比较(B类,C类，空向量，红色）。D类是远端轴突PTEN信号的定量数据。N个=24个轴突/空载体和17个轴突/miR-17–92簇载体。比例尺：B类，左下角，200μm；B类，右下角，20μm；C类，5微米*第页与GFP空矢量相比，<0.01。
图4。
图4。
局部应用雷帕霉素对远端轴突生长的影响。A类用延时显微镜在轴突室获得的典型亮场和荧光场图像显示了转染GFP-miR-17–92簇（miR-17-92）的神经元和正常神经元在轴突应用雷帕霉素30分钟后轴突长度的变化A类表示不同的时间（分钟）。白色和红色箭头分别表示时间0和不同时间点的生长锥。B类定量数据显示转染GFP-miR-17-92簇的神经元和正常神经元在60分钟内轴突生长，30分钟时将雷帕霉素（RAPA）局部应用于细胞体（仅胞体）和轴突（仅轴突）隔室（箭头所示）。N个=25个轴突/正常，N个=20个轴突/miR-17–92，N个=23轴突/miR-17–92+仅RAPA体，N个=25个轴突/miR-17–92+仅RAPA轴突*第页仅miR-17–92加RAPA轴突组与仅miR-17-92和miR-17-92 RAPA体细胞组之间的差异<0.05；#第页与正常组相比，仅miR-17-92+RAPA轴突的差异<0.05。C类显示了典型的显微图像，显示了LY294002轴突应用对转染miR-17-92簇或DIV5空载体的神经元轴突生长的影响。D类，DIV3至DIV5期间各组轴突生长的定量数据。N个=5/组**第页< 0.01; ***第页< 0.001.电子Western blot数据显示，miR-17-92簇过度表达对细胞体和轴突室中TSP1蛋白的影响，而p85和β-actin分别用作远端轴突和细胞体的内部对照。N个=7/组。比例尺：A类，20微米；C类，200微米。
图5。
图5。
内源性miR-18a和miR-19a的衰减对轴突生长的影响。A类定量RT-PCR数据显示转染发夹抑制剂miR-18a、miR-19a和cel-miR-67的神经元的轴突（Axon）和细胞体（Soma）部分中cel-miR-67、miR-18a和miR-19a的相对水平。N个=3个不同的实验，每个实验一式三份*第页<0.05和**第页与cel-miR-67相比，<0.01。B类，用荧光显微镜在轴突室获得的代表性平铺免疫荧光图像显示pNFH+DIV3上转染了发夹式抑制剂cel-miR-67（cel-miR67）、miR-18a（抗-miR-18a）和miR-19a（抗-miR-19a）的皮层神经元轴突(A类)，4类(A类)，和DIV5(A类)在文化中。C类，第3天轴突生长的定量数据。N个=6/组*第页与cel-miR-67组相比，<0.01。D类是用延时显微镜在轴突室获得的具有代表性的亮场图像，显示了转染发夹抑制剂的神经元在0和60min时轴突长度的变化。电子，定量数据显示miR-19a抑制剂显著(*第页<0.05）与cel-miR-67组相比，轴突外生长减少。N个=22轴突/cel-miR-67，N个=25个轴突/正常，N个=20个轴突/抗miR-18a，以及N个=20个轴突/抗miR-19a。F类展示了用延时显微镜在轴突室中获得的代表性图像，显示了在0和60分钟时用发夹抑制剂miR-19a（抗miR-19a）或cel-miR-67选择性转染到远端轴突的神经元轴突长度的变化。G公司，在60分钟延时实验中测量的轴突生长定量数据。白色和红色箭头分别表示0和60分钟时的生长锥*第页< 0.05.N个=26轴突/cel-miR-67和N个=22个轴突/抗miR-19a抑制剂。
图6。
图6。
内源性miR-19a对PTEN蛋白的衰减作用。A类,B类，共焦显微镜在轴突室获得的典型FISH和免疫荧光图像显示存在点状miR-19a信号(A类,B类，蓝色，箭头）和PTEN免疫反应(A类,B类，红色）沿GFP长度+轴突(A类,B类，绿色）转染GFP空载体的皮层神经元(A类，空矢量）和GFP-miR-17–92矢量(B类，miR-17–92）。C类,D类Western blot数据显示电穿孔转染神经元的远端轴突（Axon）和细胞体（Soma）中PTEN、pmTOR和pGSK-3β的水平(C类)或轴突转染(D类)使用miR-19a抑制剂或cel-miR-67抑制剂，同时分别使用p85和β-actin作为远端轴突和细胞体的内部对照。N个=3/组*第页< 0.05. 比例尺，20μm。
图7。
图7。
PTEN对轴突生长的影响。A类,B类、典型的Western blot和定量数据显示，转染pcDNA3-EGFP-PTEN质粒的神经元的远端轴突（Axon）和细胞体（Soma）中PTEN、pmTOR和pGSK-3β的蛋白水平(A类，PTEN过度表达），控制载体(A类，GFP载体），siRNA PTEN(B类)，或控制矢量(B类，控制）。N个=3/组*第页< 0.05.C类是定量数据，显示PTEN过度表达（PTEN过表达）对DIV3至DIV5期间miR-19模拟或模拟控制神经元轴突生长的影响。D类，在DIV3至DIV5期间，敲除PTEN（siRNA-PTEN）对转染miR-19a抑制剂的神经元轴突生长影响的定量数据。N个=5/组*第页< 0.05, **第页<0.01，以及***第页< 0.001.
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