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.2013年5月；41(9):4976-87.
doi:10.1093/nar/gkt182。 Epub 2013年4月4日。

LncRNA loc285194是一种p53调节的肿瘤抑制因子

刘谦（音） 1, 黄建国, 南江洲, 张自强, 阿里·张, 陆朝晖, 吴方亭, 尹元墨
附属机构

LncRNA loc285194是一种p53调节的肿瘤抑制因子

刘谦等。 核酸研究. 2013年5月.

摘要

蛋白质编码基因只占人类基因组的一小部分，而绝大多数转录物构成非编码RNA，包括长非编码RNA（lncRNAs）。越来越多的证据表明，lncRNAs在细胞生长、凋亡、肿瘤进展和转移等细胞过程的调控中发挥着关键作用。LncRNA loc285194先前被证明位于骨肉瘤的肿瘤抑制单元内，并抑制肿瘤细胞生长。然而，关于loc285194的规定尚不清楚。此外，loc285194作为潜在肿瘤抑制因子发挥作用的潜在机制尚不明确。在本研究中，我们表明loc285194是一个p53转录靶点；loc285194的异位表达在体内外均抑制肿瘤细胞的生长。通过缺失分析，我们在外显子4中确定了一个负责抑制肿瘤细胞生长的活性区域，该区域含有两个miR-211结合位点。重要的是，这种loc285194介导的生长抑制部分是由于miR-211的特异性抑制。我们进一步证明了loc285194和miR-211之间的相互抑制；与loc285194相反，miR-211促进细胞生长。最后，我们通过定量PCR阵列和组织芯片原位杂交检测结肠癌标本中loc285194的下调。总之，这些结果表明loc285194是一种p53调节的肿瘤抑制因子，部分通过抑制miR-211发挥作用。

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图1。
图1。
loc285194作为p53诱导的lncRNA的鉴定(A类)western blot检测多索诱导的p53表达。(B类)多索对HCT-116-WT和HCT-116-null细胞中loc285154表达的影响。在提取总RNA进行qRT-PCR之前，用1µg/ml的多索处理细胞24小时。误差条代表SEM，n个=3**P（P）< 0.01; 不另作说明，不重要。(C类)多索诱导HCT-116、MCF-7、HCT-8和A549细胞中的loc285194。以与（B）中相同的方式处理细胞。误差条代表SEM，n个= 3. **P（P）< 0.01; *P（P）<0.05。(D类)ISH检测到多索处理细胞中loc285194的诱导。(E类)通过外源性表达的p53诱导loc285194。HCT-116 WT细胞首先转染载体或野生型p53或突变型p53（R175H）过夜；western-blot（顶面板）证实了它们的表达。更换培养基后，细胞继续生长24小时，然后提取总RNA（底部）。误差条代表SEM，n个= 3. *P（P）< 0.05.
图2。
图2。
p53通过与loc285194启动子直接相互作用诱导loc285149。(A类)带有潜在p53反应元件（p53RE）的loc285194启动子的示意图描述。还显示了突变型p53RE和p53RE共有序列。用于ChIP分析（E）的引物的相对位置用箭头表示。(B类)野生型p53而非突变型p53诱导loc285194启动子活性。用loc285194荧光素酶报告子（loc-p-FL）和载体野生型p53或突变型p53（R175H）转染HCT-116 WT细胞。转染24小时后收集细胞进行荧光素酶检测。miR-145启动子报告子作为阳性对照。误差条代表SEM，n个= 3. **P（P）< 0.01. (C类)启动子活性的缺失分析，以确定潜在p53RE在loc285194的p53调节中的作用。Loc-p-FL是一个全长启动子；Loc-p-d1和Loc-p-d2携带涉及p53RE的缺失；如图2A所示，Loc-p-m是p53RE的突变株。(D类)图2C中相应结构体的相对荧光素酶活性。荧光素酶分析如图2B所示。误差条代表SEM，n个= 3. **P（P）< 0.01; *P（P）<0.05。(E类)通过ChIP检测确认loc285194启动子中p53与p53RE结合。对照引物Loc285194-ChIP-Ctrl-5.1和Loc285194-ChIP-Ctrl-5.1来自p53RE的外部。免疫球蛋白G和SUMO抗体作为阴性对照；p21作为阳性对照。
图3。
图3。
Loc285194抑制肿瘤细胞生长在体外. (A类)loc285194抑制HCT-116 WT细胞的细胞生长。细胞首先用载体或loc285194转染过夜，然后分裂成12孔板。从第1天到第5天，用台盼蓝法计数细胞数。误差条代表SEM，n个= 3. **P（P）< 0.01. (B类)loc285194对MCF-7细胞生长的抑制作用。实验的进行方式与图3A相同。误差条代表SEM，n个= 3. **P（P）< 0.01; *P（P）<0.05。(C类)识别能够抑制细胞生长的loc285194的最小区域。使用引物通过PCR构建缺失结构(补充表S1)然后克隆到pCDH-MSCV-EF1-GFP-T2A-Puro中。loc285194的4个外显子的长度由E1～4以上的核苷酸数量表示。E1～4由所有4个外显子组成；E2～4由外显子2、3和4组成；E1～3由外显子1、2和3组成；E4只携带外显子4；而E4-d携带第4外显子的前247个核苷酸的缺失。(D类)与图3C相对应的loc285194及其缺失结构对细胞生长的影响。实验在HCT-116 WT细胞中进行，方法与图3 A相同。误差条代表SEM，n个= 3. *P（P）<0.05。(E类)和(F类)RNAi抑制loc285197可增加HCT-116 WT（E）和HCT-116-空细胞（F）的细胞生长。首先用对照siRNA或loc285192 siRNA转染细胞过夜，然后分裂成12孔板。从第1天到第4天，细胞计数为100%。误差条代表SEM，n个= 3. **P（P）< 0.01; *P（P）< 0.05.
图4。
图4。
Loc285194在异种移植小鼠模型中抑制肿瘤生长。(A类)肿瘤生长曲线。用载体或loc285194转染HCT-116 WT细胞，然后按“材料和方法”一节所述注射到裸鼠体内。从注射肿瘤细胞后第7天开始测量肿瘤生长。误差条代表SEM，n个= 10. **P（P）< 0.01. (B类)肿瘤切除时的肿瘤重量。误差条代表SEM，n个=10*P（P）<0.05。(C类)小鼠移除肿瘤后的肿瘤总数。
图5。
图5。
miR-211和loc285194相互负调控。(A类)Loc285194在外显子4携带两个miR-211结合位点。下面显示了它们之间的对齐情况，miR-211种子序列下划线。(B类)loc285194抑制miR-211表达。首先用缺失两个miR-211结合位点的野生型loc285194（Loc-WT）或突变型loc288194（Loc-d）载体转染HCT-116细胞，转染24 h后分离总RNA进行qRT-PCR。误差条代表SEM，n个= 3. **P（P）< 0.01. (C类)miR-211对loc285194表达的影响。用载体或miR-211转染HCT-116 WT细胞，转染24 h后分离总RNA进行qRT-PCR。误差条代表SEM，n个= 3. *P（P）<0.05。(D类)loc285194对成熟miR-211、pri-miR-211和pre-miR-212的影响。误差条代表SEM，n个= 3. **P（P）< 0.01; 不另作说明，不重要。(E类)western blot检测到生物素标记的loc285194或GAS5 RNA探针拉下Ago2。GAS5通道由具有相同对比度的相同凝胶组成。(F类)在loc285194探针沉淀的颗粒中检测到miR-211，但在GAS5探针沉淀的粒子中检测不到。误差条代表SEM，n个= 3. **P（P）< 0.01.
图6。
图6。
miR-211促进HCT-116 WT细胞生长(A类)和MCF-7细胞(B类). 用载体或miR-211转染细胞过夜，然后分裂成12孔板。从第1天（100%）到第4天对细胞数进行计数。误差条代表SEM，n个= 3. **P（P）< 0.01; *P（P）< 0.05.
图7。
图7。
在结肠癌标本中，基因座285194被下调。(A类)用定量PCR检测组织扫描阵列中的loc285194。为了计算loc285194的相对表达，我们将八个正常组织样本的平均值作为一个样本，然后将肿瘤样本的每个值与正常组织的平均值进行比较。在40个肿瘤样本中，我们仅在38个样本中检测到loc285194的表达；其他两种都无法检测到，也可以算作下调，但不包括在这里。(B类)和(C类)如“材料和方法”一节所述，通过ISH检测结肠癌组织微阵列中的loc285194。（B） 显示信号强度刻度的代表性图片：“0”=负值；“+”=弱正；“++”=非常积极。（C） 与正常组织相比，肿瘤中的Loc285194下调。
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