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.2013年5月1日；190(9):4595-607.
doi:10.4049/jimmunol.1202584。 Epub 2013年4月1日。

神经元中SIRT1蛋白的过度表达通过激活多个SIRT1靶点防止实验性自身免疫性脑脊髓炎

Vamshi K Nimmagadda公司 1, 克里斯托弗·T·贝弗, Narasimha R Vattikunta公司, 赛菲·塔拉特, 瓦卡斯·艾哈迈德, 纳文·纳加拉, 大卫·特里斯勒, Susan I V法官, 沃尔特·罗亚尔第三, 克里斯·钱德拉塞卡兰, 詹姆斯·罗素, 塔帕斯·K·马卡尔
附属公司

神经元中SIRT1蛋白的过度表达通过激活多个SIRT1靶点防止实验性自身免疫性脑脊髓炎

Vamshi K Nimmagadda公司等。 免疫学杂志. .

摘要

白藜芦醇（sirtuin 1（SIRT1）的激活剂）治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）可降低疾病严重程度。这表明SIRT1（一种高度保守的NAD依赖性蛋白脱乙酰酶）的激活剂可能在EAE中具有免疫调节或神经保护治疗作用。此前，我们发现SIRT1在EAE中表达增加，表明这是一种适应性反应。在本研究中，我们使用SIRT1过度表达小鼠研究了SIRT1在调节EAE中的潜在功能。目前的研究检查了SIRT1过度表达在C57BL/6小鼠用髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白肽35-55免疫诱导的慢性EAE中的潜在神经保护和免疫调节作用。与野生型EAE小鼠相比，SIRT1抑制EAE临床症状，并预防或改变脊髓炎症表型；结果，脱髓鞘和轴突损伤减少。观察到显著的神经保护作用，SIRT1过度表达EAE小鼠脊髓中发现的凋亡细胞较少，这与脑源性神经营养因子和NAD水平增加有关。早些时候，我们发现脑源性神经营养因子和NAD在EAE中起着关键的神经保护作用。这些结果表明，SIRT1减少了慢性脱髓鞘疾病模型中的神经元丢失，并且这与炎症减少有关。

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数字

图1
图1。SIRT1和eYFP在大鼠体内的产生和表达
（A）通过将CamK2a-tTA小鼠与TRE-SIRT1–mito/eYFP小鼠杂交产生大鼠（SIRT1）。制备海马脑切片和脊髓切片，并在荧光显微镜下观察，显示mito/eYFP的神经元表达。大脑，原始放大倍数×40。脊髓，原始放大倍数×100。（B）大鼠和WT小鼠脑提取物中SIRT1蛋白的Western blot分析。GAPDH被用作负荷控制。（C）SIRT1蛋白水平的量化显示，与WT相比，大鼠的SIRT1蛋白质水平显著增加。**p<0.001，t检验。
图2
图2。SIRT1过度表达降低EAE临床评分
用MOG免疫雌性WT和SIRT1过度表达小鼠（n=8/组）35–55在CFA中乳化，然后注射百日咳毒素，以建立EAE。（A）60天内WT和SIRT1 EAE动物的临床疾病评分。（B）每组动物在60天期间的平均得分。SIRT1 EAE小鼠的平均得分显著低于WT EAE小鼠；t试验。
图3
图3。SIRT1过表达EAE小鼠的脊髓炎症减少，CD3和CD20+细胞浸润量减少
H&E染色切片显示WT EAE（B）和SIRT1 EAE（D）小鼠白质中的单核细胞浸润。然而，与野生型EAE相比，SIRT1 EAE中的炎症口袋（箭头）和炎症细胞较少。正常WT（A）和SIRT1（C）小鼠无炎症浸润。与SIRT1 EAE（H）相比，经Ab至CD3染色的WT EAE脊髓（F）显示大量T细胞（箭头）主要位于白质内。正常WT（E）和SIRT1（G）小鼠的CD3+细胞数量可以忽略不计。用B细胞标记物CD20 Ab染色的相邻切片显示，与SIRT1 EAE小鼠（L）相比，WT EAE小鼠的白质同一炎症灶中有大量CD20表达细胞（箭头）。正常的WT（I）和SIRT1（K）小鼠没有CD20+细胞。原始放大倍数×200（A–D），×400（E–L）。（百万）对炎症阳性象限的数量进行评分，并以象限总数的百分比表示（H&E；n=4）；t试验。（N）白质中CD3表达细胞的定量（n=4）；t试验。（O）白质中CD20表达细胞的定量（n=4）；t试验。
图4
图4。EAE小鼠SIRT1过度表达改变了脊髓中T细胞反应的大小
与SIRT1 EAE（D）相比，用抗体-干扰素-γ染色的WT EAE脊髓（B）切片显示，大量干扰素γ表达细胞（箭头）主要位于白质内。（i）高倍镜下显示（D）框中IFN-γ-表达细胞。与SIRT1 EAE（H）相比，用Ab至IL-17染色的WT EAE脊髓（F）切片显示大量IL-17表达细胞（箭头）主要位于白质内。（ii）高倍镜下显示（H）框中IL-17表达细胞。与WT EAE（J）相比，用Ab至IL-10染色的SIRT1 EAE脊髓（L）切片显示大量IL-10表达细胞（箭头）主要位于白质内。（iii）（L）框中IL-10表达细胞的放大倍数较高。正常WT（A、E、I）和SIRT1（C、G、K）的IFN-γ、IL-17和IL-10表达细胞数量可以忽略不计。原始放大倍数×400（A–L）。（百万）白质中IFN-γ表达细胞的定量（n=4）；t试验。（N）白质中IL-17表达细胞的定量（n=4）；t试验。（O）白质中IL-10表达细胞的定量（n=4）；t试验。
图5
图5。SIRT1过表达的EAE小鼠表现出脊髓脱髓鞘减少和髓鞘丢失
LFB染色切片显示，与SIRT1 EAE小鼠相比，WT EAE小鼠（B）的脊髓中有更多的脱髓鞘区域（缺乏蓝色染色；箭头）。正常WT（A）和SIRT1（C）脊髓切片显示均匀染色。与SIRT1 EAE脊髓（H）相比，经Ab至MBP染色的WT-EAE脊髓（F）切片显示更多的髓鞘丢失（箭头）。正常的WT（E）和SIRT1（G）小鼠表现出正常的髓鞘。原始放大倍数×200（A–H）。（一）使用NIH ImageJ软件测量脱髓鞘的总面积（n＝4）；t试验。（J）对MBP稀疏染色象限的数量进行评分，并表示为象限总数的百分比（n=4）；t试验。
图6
图6。SIRT1防止轴突损伤
与WT EAE脊髓（A）相比，用Ab至SMI 32染色的SIRT1 EAE脊髓切片显示大量磷酸化神经丝（红色）（箭头）。（B和E）切片用DAPI（蓝色）复染。（C和F）合并了TRITC和DAPI的图片。原始放大倍数×400（A–F）。（G）灰质中SMI 32表达细胞数量的量化（n=4）；t试验。
图7
图7。SIRT1通过Nampt影响NAD动态
与WT EAE脊髓（B）相比，用Ab至SIRT1染色的SIRT1 EAE脊髓切片显示，大量SIRT1表达细胞（箭头）主要位于灰质内。与WT小鼠（A）相比，正常SIRT1小鼠（C）也显示更多SIRT1。（东-西）所有用Ab到Nampt染色的切片都显示灰质中有许多Nampt表达细胞（箭头）。与正常WT（E）和EAE小鼠（F，H）相比，正常SIRT1小鼠（G）显示更多Nampt。EAE中Nampt耗尽；然而，与WT EAE相比，SIRT1 EAE具有更多Nampt。（I–L）所有用Ab至SIRT3染色的切片显示灰质中有大量SIRT3表达细胞（箭头）。各组间SIRT3染色无差异。原始放大倍数×200（A–L）。（百万）灰质中SIRT1表达细胞的定量（n=4）。p＜0.001，SIRT1 EAE小鼠与WT EAE，单因素方差分析。（N）灰质中Nampt表达细胞的定量（n=4）。p<0.001，SIRT1 EAE小鼠与WT EAE，单向方差分析。（O）灰质中SIRT3表达细胞的定量。
图8
图8。SIRT1过度表达减少EAE细胞凋亡
现场与SIRT1 EAE小鼠相比，WT EAE小鼠（B）脊髓切片的TUNEL染色显示大量凋亡细胞（棕色）（箭头）。正常的WT（A）和SIRT1（C）小鼠没有出现凋亡细胞。与SIRT1 EAE脊髓（H）相比，经Ab染色的WT EAE脊髓切片显示大量阳性细胞（箭头）。正常的WT（E）和SIRT1（G）小鼠没有出现caspase-3+细胞裂解。（一）白质中TUNEL+细胞的定量（n=4）；t试验。（J）白质中裂解caspase-3表达细胞的定量（n=4）；t试验。
图9
图9。SIRT1增加中枢神经系统中的BDNF活性
（A–D）所有用Ab到TrkB染色的切片显示灰质中有大量TrkB表达细胞（箭头）。与正常WT（A）和EAE（B，D）组相比，正常SIRT1小鼠（C）显示更多TrkB。EAE中TrkB表达降低；然而，与WT EAE相比，SIRT1 EAE具有更多的TrkB。（东-西）所有用Ab至GAD67染色的切片显示灰质中有大量GAD67表达细胞（箭头）。与正常WT（E）和EAE（F，H）组相比，正常SIRT1小鼠（G）显示更多GAD67。EAE中GAD67表达降低；然而，与WT EAE相比，SIRT1 EAE具有更多GAD67。（I–L）所有用Ab至BDNF染色的切片都显示BDNF在白质中表达。正常的WT（I）和SIRT1（K）小鼠在整个白质中表现出BDNF的均匀表达。与SIRT1 EAE（L）相比，WT EAE（J）显示更多BDNF耗竭（箭头）。（M–P）所有用Ab到BDNF染色的切片显示灰质中有大量BDNF表达细胞（箭头）。与正常WT（M）和EAE（N，P）组相比，正常SIRT1小鼠（O）表现出更多的BDNF。EAE中BDNF表达降低；然而，SIRT1 EAE（P）比WT EAE（N）具有更多的BDNF。（问）TrkB表达细胞的定量（n=4）。p＜0.049，SIRT1 EAE与WT EAE小鼠比较，t检验。（右）GAD67表达细胞的定量（n=4）。p<0.0368，SIRT1 EAE与WT EAE小鼠，t检验。（S）对BDNF缺失的象限数进行评分，并以象限总数的百分比表示（n=4）；t检验。（吨）BDNF表达细胞的定量（n=4）。p＜0.006，SIRT1 EAE与WT EAE小鼠比较，t检验。
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