Matricellular protein CCN1 promotes regression of liver fibrosis through induction of cellular senescence in hepatic myofibroblasts

doi:10.1128/MCB.00049-13

.2013年5月；33(10):2078-90.

doi:10.1128/MCB.00049-13。 Epub 2013年3月18日。

基质细胞蛋白CCN1通过诱导肝肌成纤维细胞的细胞衰老促进肝纤维化的逆转

Ki-Hyun Kim先生¹, Chih-Chiun Chen先生, 里卡多·蒙森, 莱斯特·F·刘

附属公司

PMID： 23508104
预防性维修识别码： PMC3647960型
内政部： 10.1128/MCB.00049-13

基质细胞蛋白CCN1通过诱导肝肌成纤维细胞的细胞衰老促进肝纤维化的逆转

Ki Hyun Kim（金基贤）等。分子细胞生物学. 2013年5月.

.2013年5月；33(10):2078-90.

doi:10.1128/MCB.00049-13。 Epub 2013年3月18日。

作者

Ki-Hyun Kim先生¹, Chih-Chiun Chen先生, 里卡多·蒙森, 莱斯特·F·刘

隶属关系

¹伊利诺伊大学生物化学和分子遗传学系，伊利诺伊州芝加哥，美国。

PMID： 23508104
预防性维修识别码：下午3464960
内政部： 10.1128/立方米.0049-13

摘要

肝纤维化是对慢性肝损伤的一种创伤愈合反应，与潜在病因无关，并可能发展为危及生命的肝硬化。在这里，我们发现CCN1是CCN（CYR61/CTGF/NOV）家族的基质细胞蛋白，在人类肝硬化肝细胞中积累。肝发育或再生不需要CCN1，因为这些过程在肝细胞特异性CCN1缺失的小鼠中是正常的。然而，Ccn1的表达在肝损伤时上调，其功能是抑制四氯化碳中毒或胆管结扎诱导的肝纤维化，并促进纤维化消退。CCN1通过与整合素α6β1结合，通过RAC1-NADPH氧化酶1复合物诱导活性氧物种积累，从而触发激活的肝星状细胞和门静脉成纤维细胞的细胞衰老，衰老细胞表达抗纤维化基因程序。肝细胞特异性Ccn1缺失小鼠的纤维化加剧，伴随着细胞衰老的缺陷，而肝细胞Ccn1的过度表达可减少肝纤维化，并增强衰老。此外，尾静脉输送纯化CCN1蛋白可加速已建立纤维化小鼠的纤维化消退。这些发现揭示了一种新的整合素依赖性慢性肝损伤纤维化解决机制，并将CCN1信号通路确定为治疗干预的潜在靶点。

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数字

图1
人类肝硬化和CCl后CCN1高度升高₄对小鼠的治疗。（A）人肝组织阵列中正常和肝硬化人肝组织中CCN1免疫组织化学染色的代表性图像（棕色）。棒材=100μm。（B）人类肝组织阵列中CCN1的染色强度分为低、中、高，通过Mann-Whitney U检验分析正常组织和肝硬化组织之间的差异，*P（P）*= 4.8 × 10⁻⁶（C）未经处理的小鼠和注射CCl的小鼠肝切片的免疫组织化学₄每周两次，连续四周，用对照IgG或抗CCN1抗体进行检测，并用苏木精进行复染。棒材=100μm。（D）未经治疗的小鼠和注射CCl的小鼠的肝裂解物₄连续6周，每周两次在SDS-PAGE上进行解析，然后使用抗CCN1和β-肌动蛋白抗体进行免疫印迹(n个= 3). （E）*通讯录1*通过qRT-PCR分析CCl后指定时间分离的肝脏RNA的表达₄注入(n个=6）。数据表示三次试验结果的平均值±标准偏差（SD）。相对，相对。（F）从正常肝细胞或分离的肝细胞（HC）和未经处理的小鼠（正常）或CCl后6 h的小鼠肝脏的非实质细胞（NP）中获取RNA₄治疗。*通讯录1*通过qRT-PCR分析表达。数据表示三次试验结果的平均值±SD。（G）将从正常小鼠新鲜分离的肝细胞与TNF-α（10 ng/ml）、IL-6（20 ng/ml。这个*通讯录1*用qRT-PCR分析mRNA水平(n个= 3). 数据表示在一式三份的实验中确定的结果的平均值±SD。*，*P（P）*<0.004。

图2
肝细胞特异性缺失*通讯录1*不会损害肝脏的发育或再生。（A）显示目标的示意图*通讯录1*基因组位点*通讯录1*^弗洛克斯^-^新等位基因*通讯录1*^弗洛克斯通过重组删除新霉素耐药盒的等位基因*液氧磷*站点2和3(*液氧磷*2/3），以及*通讯录1*^Δ^肝功能C介导切除后的位点。左指向三角形表示*液氧磷*地点。引物R序列只出现在第三个*液氧磷*现场。C介导的重组*液氧磷*站点2和3导致删除PGK-neo（灰框）以生成所需的*抄送1*^弗洛克斯等位基因。（B） *通讯录1*^弗洛克斯当引物F2和R用于PCR时，等位基因被检测为391-bp的DNA带。*通讯录1*^弗洛克斯^/^弗洛克斯小鼠与Alb-Cre小鼠杂交产生*通讯录1*^Δ^Hep公司老鼠。Δ*Hep公司*通过使用引物F1和R.（C）从6周龄婴儿中分离出的总肝RNA，通过119-bp DNA带的存在确认了等位基因*通讯录1*^弗洛克斯^/^弗洛克斯和*通讯录1*^Δ^Hep公司对小鼠进行分析*通讯录1*RT-PCR表达。*通讯录1*通过Image J软件分析，根据β-actin对mRNA带强度进行标准化，以校正相同水平的样本加载。低水平*通讯录1*mRNA可能来自非实质细胞。（D至F）肝再生由2/3肝部分切除术（PHx）后指定天数内残余肝重量/全肝重量的百分比决定；数据表示为平均值±SD(n个=5个）。（D）八周大*抄送1*^弗洛克斯^/^弗洛克斯(*弗洛克斯*)和*通讯录1*^Δ^Hep公司(Δ*Hep公司*)在PHx后的指定日期处死小鼠，并测量肝脏重量。（E）对不同年龄段的小鼠进行PHx试验，7天后进行评估。（F） PHx后，在指定的日期收集残余肝组织，并用Ki67抗体进行免疫组织化学染色，分析细胞增殖情况。在5个随机选择的高功率场中计算Ki67阳性细胞相对于细胞总数的百分比(n个= 3).

图3
CCN1在CCl中具有抗纤维化作用₄-诱导肝纤维化。（A至C）*通讯录1*^弗洛克斯^/^弗洛克斯(*弗洛克斯*)和*通讯录1*^Δ^Hep公司(Δ*Hep公司*)小鼠腹腔注射溶媒或CCl₄每周两次，持续6周以诱导纤维化(n个=7个）。（A）肝脏切片用天狼星红染色以显示胶原沉积。通过对随机选择的六个区域的显微照片进行图像J分析来评估纤维化区域的百分比。数据表示平均值±SD.CV，中央静脉；PT，入口三联体。棒材=100μm。（B）测定肝脏羟脯氨酸含量。（C）肝裂解物在SDS-PAGE上溶解，然后使用抗α-SMA和β-actin抗体进行蛋白质印迹(n个= 3). （D）用qRT-PCR分析所示基因的肝脏mRNA；数据显示为平均值±标准偏差*，*P（P）*< 0.005. （E至G）在单个CCl后的指定时间₄注射或重复CCl后₄连续6周（42天）诱导纤维化，测定血清ALT水平（E），并使用Ki-67（F）抗体对肝脏进行免疫组织化学分析，或进行TUNEL分析（G）。（H） qRT-PCR-量化*通讯录2*慢性CCl肝总RNA的基因表达₄-或车辆处理WT，*通讯录1*^糖尿病^/^糖尿病(*Dm公司*),*通讯录1*^弗洛克斯^/^弗洛克斯(*弗洛克斯*)，以及*抄送1*^Δ^Hep公司(Δ*Hep公司*)老鼠(n个=3个）。

图4
CCN1通过诱导肌成纤维细胞衰老抑制肝纤维化。（A）邻近系列肝脏冷冻切片*通讯录1*^弗洛克斯^/^弗洛克斯和*通讯录1*^Δ^Hep公司CCl治疗小鼠₄为了诱导纤维化，对SA-β-Gal进行染色（上面板，蓝色；n个=7）和TUNEL（下部面板，红色；n个=3）分别用曙红和DAPI进行分析和复染。方框区域被放大并显示在插页中。SA-β-Gal-和TUNEL阳性细胞的百分比显示为平均值±标准偏差。（B）*通讯录1*^弗洛克斯^/^弗洛克斯如上所述制备的肝脏切片进行p16双重染色^INK4a公司（红色）和α-SMA（绿色），用DAPI复染或用TUNEL（红色）、α-SMA双重染色（绿色）并用DAPI进行复染。p16的百分比^INK4a公司-α-SMA阳性或阴性的TUNEL阳性细胞。（C） DNA结构图*通讯录1*-过度表达（OE）转基因小鼠，显示*通讯录1*由与小鼠白蛋白基因增强子融合的最小启动子驱动的cDNA（P_阿尔布). V5表位编码序列被添加到框架中*通讯录1*3′端。pA，聚腺苷化信号。（D）将OE和WT小鼠的肝裂解物在SDS-PAGE上进行解析，并使用V5表位和β-肌动蛋白抗体进行Western印迹分析。（E）用抗CCN1抗体（棕色）对OE和WT小鼠的肝组织切片进行染色，并用血毒毒素进行复染。（F） OE和WT小鼠用CCl处理₄持续6周(n个=6），肝组织切片用天狼星红染色；量化纤维化区域。（G）测定肝脏羟脯氨酸含量。（H）肝组织切片进行SA-β-Gal染色，以评估衰老细胞的数量。白条=10μm；黑色条=100μm.*，*P（P）*< 0.02.

图5
CCN1诱导细胞衰老以抑制慢性胆汁淤积引起的纤维化。（A至E）*通讯录1*^Δ^Hep公司和*通讯录1*^弗洛克斯^/^弗洛克斯对照小鼠(n个=4个）进行胆管结扎（BDL），3周后处死进行分析。（A和B）肝切片用天狼星红（A）染色，并测定肝羟脯氨酸含量（B）。（C）肝切片用SA-β-Gal染色。纤维化和衰老的相对水平以平均值±SD表示。（D）用qRT-PCR分析纤维化相关基因的表达。（E）如图所示，在BDL后的不同天分析血清ALT水平。所示数据为平均值±SD；n个= 4. （F至H）WT和OE小鼠(n个=4个）。（F和H）肝切片用上文所述的天狼星红（F）和SA-β-Gal（H）染色，以揭示纤维化和衰老。（G）测定肝脏羟脯氨酸含量。CV，中央静脉；PT，入口三联体。棒材=100μm.*，*P（P）*< 0.02.

图6
CCN1诱导活化的HSC和PFs衰老。（A）分离的小鼠HSC在培养中被激活，并用纯化的重组CCN1蛋白（2.5μg/ml）或BSA处理6天。显示了细胞形态（上面板）、SA-β-Gal分析（下面板）和定量结果。（B）在添加CCN1、DM突变蛋白或BSA（各2.5μg/ml）培养后的指定时间，对细胞数量进行计数。（C）用BSA或CCN1处理细胞3天，并进行qRT-PCR以量化指示基因的表达。（D）用BSA、CCN1或DM处理细胞，或用整合素α功能阻断抗体预培养细胞₆（GoH3）或对照IgG（50μg/ml）。（E）用BSA或CCN1处理细胞3天，α₆β₁在检测SA-β-Gal（F）活性PFs之前，将整合素结合T1肽或非结合突变体（mut-T1；每个0.5 mM）作为竞争物。用CCN1（2.5μg/ml）或BSA处理6天，并检测SA-α-Gal活性。显示了SA-β-Gal分析和定量结果。（G）计算在BSA、CCN1或DM存在下生长的细胞数。（H）用BSA或CCN1处理PFs 3天，用qRT-PCR评估指示基因的表达。（I和J）活化的人HSC与BSA或CCN1培养3天，计算细胞总数（I）或检测细胞SA-β-Gal（J）。如有指示，在添加CCN1之前，用T1和mut-T1肽对细胞进行预处理。数据表示为三次测定的平均值±SD。*，*P（P）*< 0.02. 棒材=10μm。

图7
CCN1诱导的衰老通过RAC1-Nox1-ROS轴发生。（A）用CCN1或BSA处理活化的小鼠HSC 2 h，并装载DHC，通过荧光显微镜检测ROS，并显示定量。（B）在添加CCN1之前，用NAC（2.5 mM）或罗布青素（10μM）预处理HSC 1 h。每日补充NAC或罗布青素，3天后定量SA-β-Gal活性。（C）用CCN1处理3天的HSC通过qRT-PCR检测指示基因的表达，*P（P）*< 0.003. （D） siRNA介导的1号（siNox1#1和siNox1#2），*第4个*（siNox4），以及*种族1*（siRac1）经RT-PCR证实。使用扰码序列siRNA作为对照。（E至G）用CCN1（2.5μG/ml）处理敲除细胞2 h，并用DHC装载荧光显微镜（E），并在CCN1处理3天后检查相对细胞数（F）和SA-β-Gal阳性细胞百分比（G）。（H）用CCN1或BSA处理活化的PFs 2 H，并用DHC装载以进行荧光显微镜检查。（一） PFs用NAC（2.5 mM）和罗布青素（10μM）预处理1 h，然后添加CCN1。每日补充NAC和罗布青素，3天后定量SA-β-Gal活性。数据以平均值±标准差表示。条形图=10μm。

图8
CCN1通过整合素α发挥作用₆β₁结合位点体内.通讯录1^糖尿病^/^糖尿病(*Dm公司*)和WT小鼠(n个=6个）用CCl腹腔注射₄每周两次，持续6周。（A）组织切片用天狼星红染色，并测量纤维化区域。（B）测定肝脏羟脯氨酸含量。（C）冰冻组织切片进行SA-β-Gal活性染色。（D）在单剂量CCl后的指定时间点测量血清ALT水平₄通过注射。棒材=100μm。

图9
尾静脉输送CCN1蛋白可加速纤维化的消退。（A） CCl的示意图₄i.p.注入*通讯录1*^糖尿病^/^糖尿病小鼠和CCN1尾静脉给药。箭头表示以40μg/只小鼠注射CCN1的点。（B）在最终注射后2天，收集在消退期内注射CCN1或载体的小鼠的肝脏，并用天狼星红染色；n个=7。棒材=100μm。（C）肝脏中羟脯氨酸含量定量(n个= 3; *,*P（P）*< 0.02). 开放式酒吧，用载具或CCl治疗的小鼠₄诱导纤维化4周；灰条，CCl治疗小鼠₄持续4周，然后用CCN1或载体尾静脉注射18天纤维化缓解。（D）通过qRT-PCR分析小鼠尾静脉注射CCN1或载体后的肝脏中指示基因的表达。数据以平均值±SD表示；n个= 3.

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