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。2013年3月5日；17(3):372-85.
doi:10.1016/j.cmet.2013.02.002。

体内HIF介导的还原羧基化受柠檬酸水平调节，并使VHL缺陷细胞对谷氨酰胺缺乏敏感

保罗·加梅罗 1, 杨娟娟, 安娜·M·梅特洛, 罗西奥·佩雷斯·卡罗, 拉妮娅·贝克, 王宗伟, 亚历山德拉·阿雷奥拉, W金林·拉思梅尔, 阿里亚·奥卢米, 皮拉尔·洛佩斯·拉鲁比亚, 斯特凡诺普洛斯, Othon Iliopoulos公司
附属公司

体内HIF介导的还原羧基化受柠檬酸水平调节，并使VHL缺陷细胞对谷氨酰胺缺乏敏感

保罗·加梅罗等人。 单元格元。 。

摘要

缺氧和VHL缺乏细胞利用谷氨酰胺通过α-酮戊二酸的还原羧基化（RC）生成柠檬酸盐和脂质。为了深入了解HIF的作用和RC的分子机制，我们利用了一组与疾病相关的VHL突变体，并表明HIF的表达对于在人肾细胞癌（RCC）细胞中诱导RC是必要的和充分的。HIF表达显著降低细胞内柠檬酸水平。用醋酸盐或柠檬酸盐喂养VHL缺陷的RCC细胞，或敲除PDK-1和ACLY，恢复柠檬酸盐水平并抑制RC。这些数据表明，HIF诱导的低细胞内柠檬酸水平通过质量作用促进还原通量，以维持脂肪生成。使用[（1-13）C]谷氨酰胺，我们在小鼠中作为异种移植物生长的VHL缺陷肿瘤中证明了体内RC活性。最后，HIF使VHL缺陷细胞在体外对谷氨酰胺剥夺敏感，而谷氨酰胺酶抑制剂的全身给药抑制了小鼠异种移植肾细胞癌细胞的生长。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1。HIF失活是pVHL下调还原羧基化的必要条件
（A） 如图所示，HIF-1α、HIF-2α及其靶蛋白GLUT1在UMRC2衍生细胞系中的表达。（B） 碳原子跃迁图：[1的命运-13C类1]和[5-13C类1]本工作中，谷氨酰胺用于追踪还原羧基化（碳原子用圆圈表示）。[1-13C类1]（绿色圆圈）和[5-13C类1]（红色圆圈）谷氨酰胺衍生同位素标记在还原性TCA循环（粗体红色途径）期间保留。含有乙酰辅酶A碳骨架的代谢物以虚线圆圈突出显示。（C） 还原羧基化的相对贡献。（D和E）葡萄糖氧化对指示代谢物（D）和柠檬酸盐（E）碳的相对贡献。学生t测试对比VHL（甚高频）-重建为仅矢量或VHL（甚高频）突变体（Y98N/Y112N）。误差线代表SEM。丙酮酸、丙酮酸；乳酸；AcCoA、乙酰-CoA、Cit、柠檬酸盐；异柠檬酸异柠檬酸；α-酮戊二酸；琥珀酸；富马酸；苹果酸；草酰乙酸；天冬氨酸、天冬氨酸；谷氨酸；丙酮酸脱氢酶；ME，苹果酸酶；异柠檬酸脱氢酶；顺乌头酸酶；ACLY，ATP-柠檬酸裂解酶；GLS，谷氨酰胺酶。另请参见图S1。
图2
图2。HIF失活是pVHL下调还原性脂肪生成的必要条件
（A和B）VHL（甚高频）-在[U-13C类6]葡萄糖或[5-13C类1]谷氨酰胺。生物提取棕榈酸酯在用空载体控制（载体）、野生型EE-VHL或HA-VHL突变体重组并用[5-13C类1]谷氨酰胺（A）或[U-13C类6]葡萄糖（B）。注：M0等于70%-80%；比例高达20%。误差线代表SEM。（C）ISA方法估计的脂肪生成乙酰辅酶A的特定贡献。误差线代表95%的置信区间。另请参见图S2。
图3
图3。HIF-2α的表达足以诱导RCC细胞谷氨酰胺还原性羧基化和脂质生成
（A） 常氧条件下稳定的HIF-2α表达示意图。（B） 如图所示，pVHL、HIF-2α及其靶蛋白GLUT1在786-O衍生细胞中的表达。（C） 还原羧基化的相对贡献。（D和E）葡萄糖氧化对指示代谢物（D）和柠檬酸盐（E）碳的相对贡献。（F） 使用[U诱导HIF-2αP-A还原羧基化的证据-13C类5]谷氨酰胺。Student t检验将VHL重组或突变HIF-2α表达细胞与相应的对照组进行了比较。误差条代表SEM。（G）ISA结果显示葡萄糖氧化和谷氨酰胺还原对脂肪生成乙酰辅酶A的特定贡献（误差条表示95%置信区间）。另请参见图S3。
图4
图4。代谢通量分析VHL（甚高频）-不足和VHL（甚高频）-阳性细胞
（A） PRC3（VHL）的细胞外通量（Glc和Gln摄取、Glu和乳酸分泌）−/−)和WT8（VHL+)等基因细胞。误差线表示SEM。（B）谷氨酰胺衍生碳的净流入量由谷氨酰胺摄取量和谷氨酸分泌量之间的差异决定。误差条表示SEM。（C）组合[U的通量估算-13C类6]葡萄糖/[1-13C类1]谷氨酰胺MFA模型。学生t检验比较了WT8和PRC3细胞。谷氨酸脱氢酶；天冬氨酸转氨酶；丙酮酸脱氢酶；CS，柠檬酸合成酶；异柠檬酸脱氢酶；ACO，乌头糖；苹果酸脱氢酶；ACLY，ATP-柠檬酸裂解酶；丙酮酸在胞浆和线粒体之间的转运。误差线表示95%的置信区间。
图5
图5。柠檬酸盐水平对HIF介导的还原羧基化的调控
（A和B）RCC细胞中的柠檬酸离子计数（A）和柠檬酸-α-酮戊二酸比率（B）。Student t检验比较了重组VHL细胞和缺乏VHL细胞。（C） PDK-1击倒验证VHL（甚高频）-PRC3细胞缺陷。（D） 在PDK-1敲低条件下还原羧化对TCA循环的相对贡献。Student的t检验将PDK-1敲除与对照细胞进行了比较。（E） PRC3细胞中ACLY敲除的验证。（F） ACLY敲除对还原羧基化相对贡献的影响。Student的t检验将ACLY敲除与对照细胞进行了比较。（G和H）醋酸盐和柠檬酸盐对VHL缺失/VHL重建UMRC2细胞中还原羧基化活性的影响。醋酸盐抑制VHL缺陷UMRC2细胞中还原羧基化的相对（G）和总（H）贡献。（一） 通过添加醋酸盐拯救柠檬酸-α-酮戊二酸比率。（J和K）外源柠檬酸抑制了VHL（甚高频）-UMRC2细胞缺陷。（五十） 外源柠檬酸对（K）中柠檬酸-α-酮戊二酸比率的拯救作用。ACLY，ATP-柠檬酸裂解酶；PDK-1，丙酮酸脱氢酶激酶。误差条表示SEM。另请参见图S4。
图6
图6。体内还原性羧化活性的证据
（A） 时间进程13输注[1期间肿瘤、正常肾脏和血浆提取物中谷氨酰胺的C富集（%）-13C类1]谷氨酰胺。13使用对照非融合小鼠测定时间零点的C富集。（B） 通过GC-MS分析测定不同组织中柠檬酸M1的百分比。（C） 高分辨率13C核磁共振波谱显示13α[1肿瘤提取物中羧基的C富集-13C类1]与对照鼠相比，谷氨酰胺融合鼠。（D） 核磁共振分析13通过羧基信号的去卷积来确定输注过程中肿瘤柠檬酸盐中C的富集。柠檬酸盐信号的面积由肿瘤重量划分，并归一化为二恶烷信号。误差条表示n=3的SEM。
图7
图7。VHL（甚高频）-缺乏细胞和肿瘤对谷氨酰胺缺乏敏感
（A–E）细胞增殖标准化为在1 mM含谷氨酰胺培养基中生长的相应细胞类型。谷氨酰胺酶（GLS）抑制剂968对PRC3/WT8（A）和UMRC2细胞（B）的作用。在PRC3/WT8克隆细胞（C）和多克隆786-O细胞（D）中用α-酮戊二酸二甲酯（DM-Agg；4mM）或乙酸盐（4mM）挽救GLS抑制。GLS抑制剂BPTES在UMRC2细胞中的作用（E）。学生t测试比较VHL（甚高频）-重组细胞用于（A）、（B）和（E）中的对照细胞，DM-Akg或乙酸酯重组细胞用于仅在（C）和（D）中用968处理的相应对照细胞（括号中的星号表示重组为对照细胞的VHL之间的比较）。误差线代表SEM。（F）GLS抑制剂BPTES在nu/nu小鼠中作为异种移植物抑制人类UMRC3 RCC细胞的生长。当肿瘤达到100毫米时三，每天注射BPTES或溶媒对照，持续14天（n=12）。BPTES治疗可减小肿瘤大小和质量（见插页）。学生t检验将对照组小鼠与经BPTES治疗的小鼠进行比较（F）。误差线代表SEM。（G）图显示HIF对还原羧基化的调节。
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中的注释

  • 代谢：谷氨酰胺连接。
    伯吉斯DJ。 伯吉斯DJ。 Nat Rev癌症。2013年5月；13（5）：293。doi:10.1038/nrc3515。Epub 2013年4月12日。 Nat Rev癌症。2013 PMID：23584335 没有可用的摘要。

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