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.2013年2月28日；152(5):1173-83.
doi:10.1016/j.cell.2013.02.022。

将CRISPR重新定位为RNA引导平台，用于基因表达的序列特异性控制

雷斯琪 1, 马修·拉森, 卢克·A·吉尔伯特, 詹妮弗·阿杜德纳, 乔纳森·魏斯曼, 亚当·阿金, 温德尔·A·林
附属公司

将CRISPR重新定位为RNA引导平台，用于基因表达的序列特异性控制

雷斯琪等人。 单元格. .

勘误表in

摘要

在全基因组范围内进行靶向基因调控是查询、扰动和工程细胞系统的强大策略。在这里，我们开发了一种基于Cas9的基因表达控制方法，Cas9是一种来自II型CRISPR系统的RNA引导DNA内切酶。我们发现，缺乏内切酶活性的催化死亡Cas9与导向RNA共表达时，会产生DNA识别复合物，该复合物可以特异性干扰转录延伸、RNA聚合酶结合或转录因子结合。这个系统，我们称之为CRISPR干扰（CRISPRi），可以有效抑制大肠杆菌中靶向基因的表达，没有可检测的脱靶效应。CRISPRi可以同时抑制多个靶基因，其作用是可逆的。我们还证明了该系统可以适应哺乳动物细胞中的基因抑制。这种RNA引导的DNA识别平台提供了一种在全基因组范围内选择性干扰基因表达的简单方法。

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数字

图1
图1。CRISPR干扰系统的设计
（A） 最小干扰系统由单个蛋白质和设计的sgRNA嵌合体组成。sgRNA嵌合体由三个结构域（盒状区域）组成：一个用于特异DNA结合的20 nt互补区域，一个用于Cas9结合的42 nt发夹（Cas9手柄），以及一个由化脓链球菌野生型Cas9蛋白含有核酸酶活性。dCas9蛋白的核酸酶活性有缺陷。（B） 野生型Cas9蛋白与sgRNA结合，形成蛋白-RNA复合物。该复合物通过sgRNA和DNA靶之间的Watson-Crick碱基配对与特定DNA靶结合。在野生型Cas9的情况下，由于Cas9蛋白的核酸酶活性，DNA将被切割。我们假设dCas9仍然能够与sgRNA形成复合物并结合到特定的DNA靶点。当靶向发生在蛋白编码区时，它可以阻断RNA聚合酶和转录延伸。另请参见图S1。
图2
图2。CRISPRi有效沉默转录延伸和启动
（A） CRISPRi系统由一个可诱导的Cas9蛋白和一个设计的sgRNA嵌合体组成。dCas9包含RuvC1和HNH核酸酶域的突变。sgRNA嵌合体包含三个功能域，如图1所示。（B） 设计的sgRNA（NT1）序列和DNA靶点。NT1靶向mRFP编码区的非模板DNA链。仅显示了围绕基本图案（20 nt）的区域。碱基配对核苷酸以橙色显示，dCas9-结合发夹以蓝色显示。PAM序列以红色显示。（C）CRISPRi以股特异性方式阻断转录延伸。将含有mRFP编码基因的合成荧光报告系统插入大肠杆菌MG1655基因组（美国国家科学基金会轨迹）。与模板DNA链或非模板DNA链结合的六个sgRNAs与dCas9蛋白共表达，并通过体内荧光分析测定其对靶mRFP的影响。只有与非模板DNA链结合的sgRNAs表现出沉默（10-300倍）。对照组显示带有dCas9蛋白但没有sgRNA的细胞的荧光。（D）CRISPRi阻止转录启动。五种sgRNA被设计为与细胞周围的不同区域结合大肠杆菌启动子（J23119）。转录起始位点标记为+1。带点的椭圆形显示了初始RNAP复合物，覆盖了从−55到+20的75 bp区域。只有靶向初始RNAP复合体内区域的sgRNAs表现出抑制（P1–P4）。与转录延伸阻滞不同，沉默独立于靶DNA链。（E） CRISPRi调节是可逆的。dCas9和sgRNA（NT1）均受aTc诱导启动子的控制。细胞培养维持在指数期。在时间T=0时，向OD=0.001的细胞补充1μM的aTc。靶mRFP在10分钟内开始抑制。荧光信号以与细胞生长一致的方式衰减，表明衰减是由于细胞分裂。在240分钟内，荧光达到完全抑制的水平。在T=370 min时，aTc被从生长介质中冲走，细胞被稀释回OD=0.001。荧光在50分钟后开始增加，大约需要300分钟才能上升到与阳性对照相同的水平。阳性对照：总是没有诱导剂；阴性对照：总是用1μM的aTc诱导剂。（C）–（E）中的荧光结果表示至少三个生物复制品的平均值和SEM。另请参见图S2和S3。
图3
图3。通过阻断转录延伸实现CRISPRi功能
（A） 对FLAG标记的RNAP分子进行免疫沉淀，并对相关的新生mRNA转录物进行测序。（上）不含sgRNA细胞中新生mRFP转录物的测序结果。（下）含有sgRNA的细胞。在存在sgRNA时，在目标位点上游19 bp处观察到强烈的转录暂停，之后测序读取数急剧下降。（B） 基于RNAP和dCas9-sgRNA之间的物理碰撞提出了一种CRISPRi机制。RNAP中心到其前缘的距离为~19bp，这与我们测量的转录暂停位点和sgRNA碱基区3′之间的距离很好地匹配。暂停的RNAP在遇到dCas9-sgRNA障碍时中止转录延伸。
图4
图4。CRISPRi系统的靶向特异性
（A） 基因组尺度的mRNA测序（RNA-seq）证实CRISPRi靶向没有靶向效应。使用与mRFP编码区结合的sgRNA NT1。突出显示了dCas9、mRFP和sfGFP基因。（B） 多个sgRNAs可以独立沉默同一细胞中的两个荧光蛋白报告子。每个sgRNA都特异性抑制其同源基因，但不抑制其他基因。当两个sgRNAs都存在时，两个基因都会沉默。误差条表示至少三个生物复制品的SEM。（C） 使用两个sgRNAs控制两个荧光蛋白的显微图像。（顶部）大肠杆菌细胞；（中间）RFP渠道；（底部）GFP通道。一种sgRNA和dCas9的共表达只会沉默同源荧光蛋白，而不会沉默另一种。敲除效应很强，因为在某些荧光蛋白沉默的细胞中几乎没有观察到荧光。比例尺，10μm。对照组显示细胞没有任何荧光蛋白报告物。荧光结果表示至少三个生物复制品的平均值和SEM。另请参见图S4。
图5
图5。影响消声效率的因素特征
（A） 我们测量了具有不同靶位点的sgRNAs对同一基因（距离翻译起始密码子的距离）的沉默效果，以及具有不同长度的碱基对同一靶位点（基于NT1）的sgRNA。（B） 沉默效率与翻译起始密码子的目标距离呈负相关（橙色，mRFP；绿色，sfGFP）。通过将每个sgRNA的抑制标准化为具有最高抑制倍数变化的sgRNA的抑制来计算相对抑制活性。误差条代表三个生物复制品的SEM。（C） sgRNA和靶DNA之间Watson-Crick碱基区的长度影响抑制效率。基极区的延伸都表现出较强的消声效应，截断显著降低了抑制。可检测抑制的最短基线区长度为12 bp。误差条代表三个生物复制品的SEM。（D） 我们将单个错配引入sgRNA的每个核苷酸中（NT1；图2B），并测量单个错配如何影响抑制效率。可以看出对整体消声具有明显重要性的三个分区。它们显示了阶跃函数。第一个7nt区域对沉默至关重要，可能构成一个“种子”区域，用于探测与DNA靶点结合的sgRNAs。PAM序列（NGG）是沉默必不可少的。误差条代表三个生物复制品的SEM。（E） 相邻双错配的sgRNAs的沉默效应。单个错配sgRNAs的相对抑制活性以灰色显示，错配位置标记在底部。双错配sgRNAs的实验测定活性以蓝色显示。通过乘以两个单错配的sgRNA的效应计算出的活性以白色显示，并标有“Com”。在大多数情况下，双错配sgRNA沉默活性只是单错配sg RNA活性的乘积（图S5B除外），表明单个错配之间存在独立的关系。误差条代表三个生物复制品的SEM。（F） 使用双sgRNAs靶向单个mRFP基因的组合沉默效应。使用针对同一基因的两个sgRNAs，整体击倒效果可以提高近1000倍。当两个sgRNAs与同一基因的非重叠序列结合时，抑制作用增强。当两个sgRNAs靶向重叠区域时，抑制被抑制。误差条代表三个生物复制品的SEM。荧光结果表示至少三个生物重复的平均值和SEM。另请参见图S5和S6。
图6
图6。利用CRISPRi基因敲除技术分析复杂调控网络的功能
（A） sgRNAs被设计用来敲除基因(塞浦路斯,慢性肾衰,lacI公司,lacZ公司,花边，以及拉卡)lac调控途径或阻断转录操作位点（A/P/O）。拉西是结构基因操纵子通过结合到转录操作位点（O位点）。这个lacZ公司该基因编码一种催化乳糖转化为葡萄糖的酶。少许反式-作用宿主基因，如塞浦路斯和慢性肾衰参与激活结构基因系统。cAMP-CRP复合物结合到转录操作位点（a位点）并招募RNA聚合酶结合到P位点，从而启动转录结构基因IPTG是一种抑制LacI功能的化学物质，可诱导LacZ表达。（B） 无（白色）和（灰色）IPTG的敲除菌株的β-半乳糖苷酶测定。控制表明，添加IPTG可以诱导不受CRISPRi扰动的野生型细胞。靶向LacZ的sgRNA强烈抑制LacZ表达，即使存在IPTG。当靶向LacI时，即使没有IPTG，LacZ表达也很高。瞄准塞浦路斯和慢性肾衰基因导致IPTG存在时LacZ表达水平降低。存在1 mM cAMP救援塞浦路斯击倒，但不是慢性肾衰击倒。阻断转录操作位点导致LacZ抑制，这表明这些是重要的顺式-LacZ的代理监管站点。扰动后，显示LacZ表达减少（红色箭头）和增加（绿色箭头）。误差条代表三个生物复制品的SEM。（C） 击倒实验使我们能够描述调控器在lac调控电路中的作用。数据显示在二维（2D）图上，x轴显示没有IPTG的LacZ活性，y轴显示有IPTG的LacZ活性。卵圆形沿着每一个轴的延伸显示了三个生物复制品的SEM。β-半乳糖苷酶测定结果代表三个生物复制品的平均值和扫描电镜。有关LacI和LacZ靶向的RNA-seq数据，另请参见图S4。
图7
图7。CRISPRi能抑制人细胞基因表达
（A） HEK293细胞中的CRISPRi系统。通过逆转录病毒感染将SV40-EGFP表达盒插入基因组中。dCas9蛋白经过密码优化，并与三份NLS序列融合。sgRNA由RNA聚合酶III U6载体表达。dCas9和靶向EGFP非模板DNA链的sgRNA（eNT2）共同转染可降低荧光（约46%），而dCas9或sgRNA单独表达则无影响。（B） dCas9:sgRNA介导的抑制依赖于靶基因座。七个sgRNAs被设计用于靶向模板或非模板链上EGFP编码序列的不同区域。只有eNT2和eNT5表现出中度抑制。EGFP荧光（靶向报告物）显示为绿色，而mCherry荧光（对照报告物）则显示为粉红色。（A）和（B）的荧光结果代表两个生物复制品的平均值和误差。另请参见图S7。
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中的注释

  • CRISPR静音。
    de Souza北。 de Souza北。 自然方法。2013年5月；10(5):380-1. doi:10.1038/nmeth.2466。 自然方法。2013 PMID：23762905 没有可用的摘要。

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