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.2013;8（2）：e56367。
doi:10.1371/journal.pone.0056367。 Epub 2013年2月21日。

丙型肝炎病毒诱导的AP-1和Sp1激活TGF-β1启动子：TGF-α1在肝星状细胞活化和侵袭中的作用

喷枪D压力机 1, 史蒂文·麦克雷, 古兰·瓦利斯
附属公司

丙型肝炎病毒诱导的AP-1和Sp1激活TGF-β1启动子：TGF-α1在肝星状细胞活化和侵袭中的作用

Lance D冲压机等。 公共科学图书馆综合版. 2013.

缩回

摘要

我们以前的研究表明，转化生长因子β1（TGF-β1）在HCV感染的人肝癌细胞中的诱导和成熟。在本研究中，我们研究了TGF-β1基因表达对HCV感染的反应的分子机制。我们证明HCV诱导的转录因子AP-1、Sp1、NF-κB和STAT-3参与TGF-β1基因的表达。利用染色质免疫沉淀（ChIP）分析，我们进一步表明AP-1和Sp1在体内与HCV感染细胞中的TGF-b1启动子相互作用。此外，我们证明HCV诱导的TGF-β1基因表达是通过激活细胞激酶如p38 MAPK、Src、JNK和MEK1/2介导的。接下来，我们确定了分泌的生物活性TGF-β1在人类肝星状细胞（HSC）激活和侵袭中的作用。使用siRNA方法，我们表明HCV诱导的生物活性TGF-β1对诱导α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和1型胶原（HSC活化和增殖的标志物）的诱导至关重要。我们使用transwell Boyden室进一步证明了HCV诱导的生物活性TGF-β1在HSC侵袭/细胞迁移中的潜在作用。我们的结果也表明了HCV诱导的TGF-β1在HCV复制和释放中的作用。总之，这些观察提供了对TGF-β1启动子激活以及HSC激活和侵袭机制的深入了解，这些可能表现在与HCV感染相关的肝纤维化中。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：Gulam Waris博士目前担任《PLOS ONE》的学术编辑。这并不会改变作者对所有PLOS ONE数据和材料共享政策的遵守。

数字

图1
图1。HCV激活TGF-β1启动子。
A） 显示野生型TGF-β1启动子荧光素酶报告子（phTG1）和各种缺失结构（phTG5、phTG6、phTG7和phTG7-4）。两个负调控序列（NRS）显示在−453和−1362之间的区域以及USF1/2结合区域。两个AP-1结合位点位于−453和−323之间。两个Sp1结合位点位于−323和−175之间。三个Sp1位点和两个Egr-1位点位于−175和−60之间。B） 根据制造商的说明（Invitrogen，CA），使用Lipofectamine 2000用TGF-β1启动子萤光素酶报告构建体（phTG1、TG5、TG6、TG7、TG7-4）或载体对照（500ng）转染模拟和HCV感染的细胞。在转染后36小时，细胞裂解物接受双重核糖核酸酶报告分析。这些值代表三次独立实验的平均标准偏差。*与模拟细胞相比，表示p<0.05。C） 如上所述，用TGF-β1启动子荧光素酶报告子构建物（phTG1、TG5、TG6、TG7、TG7-4）或载体对照（500 ng）以及表达HCV NS3、NS3/4A或NS5A（500 ng。在转染后36小时，细胞裂解物接受双重核糖核酸酶报告分析。这些值代表三次独立实验的平均标准偏差。*与模拟细胞相比，表示p<0.05。数据表示荧光素酶相对于模拟细胞的活性。
图2
图2。丙型肝炎病毒诱导的转录因子在转化生长因子-β1启动子激活中的作用。
A） 用500 ng野生型（phTG1−1362/+11）、缺失突变体（phTG5−453/+11）TGF-β1启动子荧光素酶报告子构建物和载体控制转染模拟和HCV感染细胞。在转染后36小时，用AP-1抑制剂（Bar#1；丹参酮IIA，80µM）、IkB激酶抑制剂（Bar#4和5；Bay 11-7085，80μM和NF-κB活化抑制剂80µM）和Sp1抑制剂（Bar#6；密特拉霉素A，100µM。还将500 ng TGF-β1启动子荧光素酶报告子和500 ng STAT-3显性阴性突变体（Bar#7；pSG5hSTAT3-β；将STAT-3酪氨酸磷酸化位点705突变为苯丙氨酸；Bar#8；STAT3-S727A；将STAT3丝氨酸磷酸化位点727突变为丙氨酸）转染模拟和HCV感染细胞NF-κB的抑制亚单位（Bar#9；IκBαS32A/S36A；IkBα丝氨酸32,36突变为丙氨酸）。细胞裂解产物进行双核糖核酸酶报告分析。这些值代表三次独立实验的平均标准偏差。*表示与模拟细胞相比p<0.05。**表示与未经处理的启动子相比p<0.05。B） 如上所述，用抑制剂和dn突变体治疗感染了模拟和HCV的细胞。提取细胞总RNA，使用TGF-β1特异性引物和SYBR绿色探针分析TGF-？mRNA。这些值代表三次独立实验的平均标准偏差。*表示与模拟细胞相比p<0.05。**表示与未经治疗的启动子相比p<0.05表示与病媒控制相比p<0.05。C） 如上文所述，用抑制剂处理模拟和HCV感染细胞，或用显性阴性突变体转染细胞。按照材料和方法中的描述，使用CytoToxONE均质膜完整性分析测试样品的细胞毒性。数据表示荧光素酶相对于模拟细胞的活性。D、 用表达IkBα（IkB a S32A/S36A）、STAT-3（pSG5hSTAT3-β和STAT3-S727A）和AP-1（pcDNA3.1/His-TAM67）显性负蛋白的载体转染E和F型HCV感染细胞。在转染后48小时，制备细胞裂解物，并使用抗IkBα、STAT-3和c-Jun抗体进行western blot分析。肌动蛋白被用作蛋白质负荷控制。
图3
图3。TGF-β1启动子荧光素酶报告子上AP-1和Sp1结合位点的突变分析。
A） 如前所述，从序列数据推导出TGF-β1启动子序列上的AP-1和Sp1结合位点。pGL3载体包括与荧光素酶基因融合的野生型TGF-β1片段–1362/+11，并用作材料和方法中所述的定点突变的模板。如图所示，AP-1和Sp1结合位点通过共有序列中两个碱基的改变而突变。替换的基础用斜体表示，并用方框突出显示。显示了用于转染实验的野生型和突变质粒。B） 用500 ng野生型phTG1和phTG5以及突变型TGF-β1荧光素酶构建物（Mut-1、Mut-2、Mut-3）转染感染了模拟和HCV的细胞。在转染后36小时收集细胞裂解物，并进行双核糖核酸酶报告分析。这些值代表三次独立实验的平均标准偏差。*表示与模拟细胞相比p<0.05。**与野生型phTG1和phTG5结构相比，表示p<0.05。C） 用抗C-Jun、C-Fos和Sp1抗体或正常兔IgG免疫沉淀来自模拟细胞和HCV感染细胞的交叉染色质。利用引物和SYBR绿色探针，通过定量RT-PCR测定免疫沉淀DNA上的AP-1和Sp1结合位点。免疫沉淀前输入染色质（输入）的扩增作为染色质提取和PCR扩增的阳性对照。使用非特异性抗体（正常人IgG）的染色质免疫沉淀作为阴性对照。这些数据表示相对于模拟细胞的萤光素酶活性。这些值代表三次独立实验的平均标准偏差。*与模拟细胞相比，表示p<0.05。D） 在用0.5µg/ml溴化乙锭染色的1%琼脂糖凝胶上观察5微升PCR产物。
图4
图4。HCV诱导的信号通路对转录因子激活的影响。
A） 用500 ng pLucTKS3、p3x-κB-Luc或（AP-1）转染模拟和HCV感染细胞4-Luc reporter构建。转染后36小时，用细胞内钙螯合剂（BAPTA-AM，50µM）或抗氧化剂（PDTC，100µM。收集细胞裂解物并进行双核糖核酸酶报告分析。这些值代表三次独立实验的平均标准偏差*与模拟细胞相比，表示p<0.05**与用抑制剂模拟治疗的HCV感染者相比，表示p<0.05。数据表示荧光素酶相对于模拟细胞的活性。B和C）EMSA是在存在IRDye 700标记的寡核苷酸的情况下进行的，这些寡核苷酸来自TGF-β1启动子（包含AP-1和Sp1结合位点）以及来自模拟（Huh7.5）和HCV感染细胞的核裂解物。车道1，单独探测；通道2和3，来自模拟和HCV感染细胞的等量核裂解物；车道4与车道3相同，但孵育有200倍的未标记寡核苷酸；通道5，DNA蛋白复合物与抗c-Jun或抗Sp1在RT培养20分钟。
图5
图5。HCV诱导的细胞激酶对TGF-β1启动子激活的作用。
A） 用500 ng phTG1和phTG5 TGF-β1启动子萤光素酶报告基因转染模拟和HCV感染的细胞。在转染后36小时，将细胞血清饥饿4小时，并用p38 MAPK（SB203580，10µM）、JNK（SP600125，30µM）、PI3K（LY294002，50µM）、Src（SU6656，10µM）、JAK 2/3（AG490，100µM）和MEK1/2（UO126，20µM）抑制剂处理12小时。对细胞裂解物进行双荧光素酶报告基因测定。这些值代表三次独立实验的平均标准偏差*与模拟细胞相比，表示p<0.05**与HCV感染的模拟处理细胞相比，表示p<0.05。B） 如材料和方法中所述，用激酶抑制剂处理模拟和HCV感染细胞。提取细胞总RNA，用TGF-β1特异性引物和SYBR绿色荧光染料分析TGF-？mRNA。这些值代表三次独立实验的平均标准偏差*与模拟细胞相比，表示p<0.05**与HCV感染的模拟处理细胞相比，表示p<0.05。C） 如材料和方法中所述，用激酶抑制剂处理模拟和HCV感染细胞。按照材料和方法中的描述，使用CytoToxONE均质膜完整性分析对细胞进行生长抑制分析。
图6
图6。HCV诱导的转录因子对TGF-β1分泌的影响。
A） 用AP-1、Sp1、IkB激酶抑制剂或转染AP-1、STAT-3或IκBα的dn突变体处理模拟和HCV感染细胞。在转染后36 h，通过TGF-β1特异性ELISA测定CM中总分泌的TGF-α1。这些值代表三次独立实验的平均标准偏差*与模拟细胞相比，表示p<0.05**与HCV感染的模拟处理细胞相比，表示p<0.05。B） 如上所述，使用材料和方法中所述的水貂肺上皮细胞对CM进行生长抑制试验。此处显示的数据代表三次独立实验的平均标准偏差*与模拟细胞相比，表示p<0.05**与HCV感染的模拟处理细胞相比，表示p<0.05。
图7
图7。HCV诱导的TGF-β1、furin和TSP-1对肝星状细胞活化的影响。
A） 如材料和方法中所述，用siGFP、siTGF-β1、sifurin和siTSP-1转染模型和HCV感染细胞。为了确定沉默水平，提取细胞总RNA，并使用furin、TSP-1和TGF-β1特异性引物进行定量RT-PCR。此处显示的数据代表三次独立实验的平均标准偏差*与模拟细胞相比，表示p<0.05**与HCV感染的模拟转染细胞相比，表示p<0.05。B） 使用抗TGF-β1、furin和TSP-1抗体对来自上述siRNA转染细胞的等量细胞裂解物进行western blot分析。通道1，模拟（Huh7.5）细胞的裂解物；通道2，HCV感染细胞；通道3和通道4，HCV感染细胞转染siGFP或siTGF-β1、sifurin和siTSP-1。肌动蛋白和白蛋白用作蛋白质负荷对照。C） 在与从用siGFP、siTGF-β1、sifurin或siTSP-1转染的HCV感染的Huh-7.5细胞中收集的条件培养基（CM）孵育24小时之前，生长HSC系LX-2并使血清饥饿48小时。从LX-2细胞中提取总细胞RNA，并通过定量RT-PCR测定α-SMA和Col 1α1mRNA的水平。此处显示的数据表示三次独立实验的平均标准偏差，一式三份*与来自模拟细胞的CM孵育的LX-2细胞相比，表示p<0.05**与来自HCV感染细胞的CM孵育的LX-2细胞相比，表示p<0.05。D） 使用抗α-SMA和GAPDH抗体对上述细胞的细胞裂解产物进行免疫印迹分析。通道1和通道2，模拟和HCV感染细胞的CM孵育的LX-2细胞裂解物；通道3-6，LX-2细胞与CM孵育后的裂解物，来自转染siGFP、siTGF-β1、sifurin和siTSP-1的HCV感染细胞。底部面板显示用抗GAPDH一级抗体进行的蛋白质负载控制免疫印迹。
图8
图8。HCV诱导的TGF-β1对肝星状细胞侵袭的影响。
A） 侵入分析示意图。B） 将LX-2细胞接种在无血清DMEM的上腔中。来自模拟和HCV感染细胞的CM以及转染siTGF-β1和siGFP的HCV感染的细胞用于下室。博伊登室在37岁时孵化°C培养48小时，检测HSC侵袭情况。通过在35倍放大率下每孔多个显微镜视野中计数迁移的细胞来评估侵袭。C） 根据制造商的方案（加州Cell Biolabs公司），还使用提取液对HSC侵入进行量化，并在560 nm处记录吸光度。此处显示的数据表示两个独立实验的平均标准偏差，两个实验重复进行*与使用模拟细胞CM处理的LX-2s相比，表示p<0.05**与HCV感染细胞的CM处理的LX-2s相比，表示p<0.05。
图9
图9。TGF-β1、furin和TSP-1对HCV复制和释放的影响。
A） 在第4天从HCV感染的模拟细胞和转染siRNA的细胞中收集总细胞RNA，并通过定量RT-PCR测定HCV RNA水平。此处显示的数据代表三次独立实验的平均标准偏差*与模拟细胞相比，表示p<0.05**与HCV感染的模拟转染细胞相比，表示p<0.05。B） 在第7天从上述细胞中收集2毫升CM，并按照材料和方法中所述通过定量RT-PCR测定HCV释放水平。此处显示的数据代表三次独立实验的平均标准偏差*与模拟细胞相比，表示p<0.05**与HCV感染的模拟转染细胞相比，表示p<0.05。C） 如材料和方法中所述，为共焦激光扫描显微镜制备模拟、HCV感染细胞以及转染siTGF-β1和siGFP的HCV感染的细胞。简单地说，细胞在RT下与BODIPY孵育1小时，并用PBS洗涤。DAPI用作核染色剂。箭头表示脂滴。棒材，10µM。
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