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.2013年4月18日；121(16):3117-25.
doi:10.1182/bloud-2012-12-469544。 Epub 2013年2月21日。

蛋白激酶Cδ（PKCδ）功能丧失导致人类B细胞淋巴增殖综合征

惠孙奎 1, 朱莉·尼梅拉, 安德烈亚·兰杰尔·桑托斯, 张明昌, 斯蒂芬妮娅·皮塔卢加, 詹妮弗·L·斯托达德, 阿什利·哈西, 摩西·O·埃夫布万, 黛布拉长期骄傲, 道格拉斯·B·库恩斯, C露西公园, 托马斯·A·弗利舍, 古尔布·乌泽尔, 乔·奥利维拉
附属公司

蛋白激酶Cδ（PKCδ）功能丧失导致人类B细胞淋巴增殖综合征

惠孙奎等。 血液. .

摘要

淋巴细胞凋亡缺陷导致与自身免疫现象相关的慢性淋巴结病和/或脾肿大。人类凋亡障碍的原型是自身免疫性淋巴增生综合征（ALPS），它是由FAS凋亡途径的突变引起的。最近，还描述了一种称为RAS相关自身免疫性白细胞增生性疾病的ALPS样疾病患者，在该疾病中发现了NRAS或KRAS的体细胞突变。尽管取得了这一进展，但许多ALPS样疾病患者的基因仍不明确。我们在一名患有慢性淋巴结病、脾肿大、自身抗体、免疫球蛋白升高和与慢性低度Epstein-Barr病毒感染相关的自然杀伤功能障碍的患者中发现了PRKCD（PKCδ）的纯合子功能丧失突变。这种突变显著降低了蛋白表达并导致体外B细胞过度增殖，这与PKCδ基因敲除小鼠的表型相似。淋巴结显示出强烈的滤泡增生，也反映了小鼠模型。循环淋巴细胞的免疫表型显示CD5+CD20+B细胞扩增。正常单核细胞中PKCδ的敲除在体外重现了B细胞的过度增殖表型。患者源性EBV转化的B细胞系中PKCδ的重建部分恢复了佛波醇-12-苦味酸-13-醋酸盐诱导的细胞死亡。总之，纯合PRKCD突变导致B细胞过度增殖和凋亡缺陷，从而导致人类淋巴细胞积聚和自身抗体生成，并破坏自然杀伤细胞功能。

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数字

图1
图1
患者的临床、免疫学、组织病理学和特征。（A） 患者谱系。父母没有任何已知的血缘关系。所有3名未受影响的儿童和父母在PRKCD、，而患者代表了唯一的受影响后代，他们是这种变化的纯合子。（B） 冠状位计算机断层扫描图像显示治疗前（左）和治疗后（右）出现大量肝脾肿大和纵隔、腋窝、腹股沟淋巴结病。
图2
图2
与来自其他健康淋巴结的反应性淋巴结相比，患者淋巴结的组织病理学。（A） 具有极化生发中心和外套膜的H&E染色反应性卵泡；（D） MIB-1的IHC：生发中心内增殖的淋巴细胞呈阳性，呈极化（暗区）；（G） BCL-6（GC形成的主要调节因子）的IHC：整个反应性生发中心对BCL-6呈阳性。（J） PKCδ的IHC染色显示广泛阳性细胞质染色。所有剩余的照片均来自我们患者的淋巴结活检：（B）和（C）滤泡的H&E染色，滤泡具有不同程度的不明确的生发中心，无披风。（E） MIB-1的（F）IHC：不同生发中心的增殖程度不同，缺乏极化。（H） 和（I）BCL-6的IHC：与反应性卵泡相比，每个生发中心内存在相对少量的阳性细胞。（K） 与（J）相比，患者淋巴结中没有PKCδ染色。
图3
图3
PKCδ突变和蛋白表达的鉴定。（A） 的排序PRKCD公司从索引患者、父母和3个兄弟姐妹的血液中提取基因组DNA。（B） PKC的免疫印迹分析δ以及患者和正常志愿者细胞中的控制蛋白β-actin。用F（ab′）激活纯化的B细胞2对IgM（10μg/mL）、IL-4（50 ng/mL）和CD40配体（10μg/mL）特异5天，然后对细胞裂解物进行western blot（WB）分析。使用PBMC和EBV转化的B细胞的蛋白裂解物，无需刺激。（C）PRKCD公司PBMC和EBV转化的B细胞中的基因表达水平表现为正常细胞的相对表达。数据表示为n=3个单独实验的平均值±SE。
图4
图4
细胞增殖和细胞因子生成。（A） 富集的B细胞用CFSE（1μM）染色并用F（ab′）刺激2对抗IgM（10μg/mL）、IL-4（50 ng/mL）和CD40配体（10μg/mL）特异5天。通过CFSE稀释评估至少经历一次细胞分裂的细胞百分比（线以上的数字）。灰色固体峰是一个非模拟细胞。（B） 对来自3个正常和2个不同批次患者的EBV转化的B细胞进行7天的计数。（C） 用CFSE（1μM）和刺激的Dynabeads T细胞激活剂CD3/CD28对PBMC染色3天。PHA，植物血凝素。（D） 和（E）如所指示的那样刺激富集的B细胞。48小时后，收集无细胞上清液，并按照材料和方法中细胞因子测量部分的描述测量细胞因子。面板A和C的数据代表了3个独立实验。来自面板D和E的数据表示为n=3个单独实验的平均值±SE。
图5
图5
PKCδ诱导的B细胞增殖的抑制。（A） 用siRNA-普遍阴性对照或siRNA转染B细胞或PBMC-PRKCD公司（300 nM），根据材料和方法进行Amaxa电泳。3天后，制备细胞裂解物并进行western blots（WB）。（B） 用siRNA-普遍阴性对照或siRNA转染B细胞或PBMC-PRKCD公司（300 nM）。第二天用CFSE（1μM）染色细胞，并用特异性抗IgM（10μg/mL）、IL-4（50 ng/mL）和CD40配体（10μg/mL）的F（ab′）2刺激5天（B细胞）或Dynabeads T细胞活化剂CD3/CD28刺激3天（PBMCs）。通过CFSE稀释评估至少经历一次细胞分裂的细胞百分比（线以上的数字）。灰色固体峰为非刺激细胞。数据代表了3个独立实验。
图6
图6
患者的B细胞对PMA诱导的细胞死亡具有抵抗力。（A） 和（C）EBV转化的B细胞或PBMC与PMA（100 ng/mL）或APO-1-3/蛋白A（各1μg/mK）培养。24小时（对于EBV B细胞）或48小时（对于PBMC）后，用DiOC6（40 nM）对细胞染色15分钟，并通过流式细胞术通过恒定时间采集对活细胞进行计数。（B） 用或不使用PMA或APO-1-3刺激EBV转化的B细胞6小时，用碘化丙啶（PI；50 ng/mL）染色15分钟，并用流式细胞仪进行分析。（D） 使用或不使用PMA刺激EBV转化的B细胞3小时，并根据制造商的说明用FITC-激活的caspase-3（BD Pharmingen）对细胞进行染色。（E） （F）使用慢病毒系统，用pLVX-IRES-ZsGreen控制载体或pLVX-IR ES-Zs Green-RRKCD转导患者转化的EBV。通过western blots（WB；E）分析PKCδ的过度表达。用PMA（100 ng/mL）刺激细胞24小时，用流式细胞仪通过恒定时间采集（F）计数活细胞。通过对活性ZsGreen表达细胞进行门控分析。数据表示为3个单独实验的平均值±SE*P（P）<.05（学生）t吨与未处理细胞的比较试验。
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